出丕医垫兰Ｑ！兰生笙兰至鲞筮兰三翅宫颈癌患者淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ及血清ＳＣＣＡ检测的临床意义王洪珍，刘大标，殷朝晖。陈英（镇江市第四人民医院，江苏镇江２１２０００）摘要：目的探讨宫颈癌患者淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ及术前血清鳞状细胞癌抗原（ＳＣＣＡ）水平与淋巴结转移之间的关系。方法采用实时荧光定量ＰＣＲ法检测５０例宫颈癌患者的宫颈原发部位及盆腔淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ，同时检测其术前血清ＳＣＣＡ水平。结果宫颈癌患者原发部位ＨＰＶ，ＤＮＡ检出率为９２．０％（４６／５０），盆腔淋巴结中ＨＰＶ．ＤＮＡ检出率为２８．ｏ％（１４／５０），１１例组织学阳性淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ检出率为１００％（１１／１１），３９例组织学阴性淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ检出率为７．７％（３／３９）；６０％宫颈癌患者血ＳＣＣＡ升高（３０／５０）；淋巴结转移与淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ阳性和术前ＳＣＣＡ水平相关（Ｐ均＜０．０１），淋巴结ＨＰＶ－ＤＮＡ阳性与术前ＳＣＣＡ水平相关（Ｐ＜０．０５）。结论ＨＰＶ—ＤＮＡ在阳性淋巴结中高度表达，与淋巴结转移密切相关，术前ＳＣＣＡ水平与淋巴结转移相关，术前ＳＣＣＡ水平和淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ阳性可以作为淋巴结转移的预测因子。关键词：宫颈肿瘤；乳头状瘤病毒，人；淋巴结转移；鳞状上皮癌抗原中图分类号：Ｒ７３７．３３文献标志码：Ｂ文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１２）３３－００５５－０３宫颈癌是世界范围内女性最常见的第３大肿和血清ＳＣＣＡ检测。收集病理科石蜡包埋淋巴结，瘤¨－，在我国为女性肿瘤致死的第２位原因。大量的流行病学和分子生物学研究发现，９９．７％以上的宫颈癌有ＨＰＶ感染旧Ｊ，早期宫颈癌淋巴结转移是影响患者预后的重要因素，其关系到手术治疗后的选分左右闭孔、左右髂总、左右髂内、左右髂外８组。１．２方法１．２．１荧光定量ＰＣＲ检测ＨＰＶ．ＤＮＡＤＮＡ的提取：从每一蜡块中切下厚约８岬的切片著于，取不同水平的切片２—３片，混合放入反应管中。经３次二甲苯脱蜡、无水乙醇洗涤后加入蛋白酶Ｋ消化液，５５℃水浴３ｈ后，１００℃煮１０ｒａｉｎ。离心取上清液，最后加入ＤＮＡ提取液（深圳市港龙生物技术有择。目前，我们主要依靠术后常规组织病理学判断淋巴结转移与否。为进一步提高淋巴结转移判断的阳性率，国内外学者致力于寻找合适的分子水平标志物，其中淋巴结组织中ＨＰＶ—ＤＮＡ及血清鳞状细胞癌抗原（ＳＣＣＡ）成为了研究热点。我们采用荧光定量ＰＣＲ法对患者术前宫颈脱落细胞和术后石蜡包埋的淋巴结进行ＨＰＶ．ＤＮＡ检测，同时测其术前限公司提供），振荡混匀，１００ｑＣ水浴１０ｒａｉｎ，离心后取上清液作为待测ＤＮＡ样品。荧光ＰＣＲ扩增：ＨＰＶ核酸检测试剂盒由港龙生物技术（深圳）有限公司提供，按试剂盒操作流程说明进行，能在同一ＰＥＲ反应管中检测１３种高危型ＨＰＶ（ＨＰＶｌ６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６８）的脱氧核糖核酸。将ＨＰＶＰＣＲ反应液、Ｔａｑ酶及ＵＮＧ按比例血清ＳＣＣＡ水平，以探讨检测盆腔淋巴结ＨＰＶ－ＤＮＡ和术前血清ＳＣＣＡ水平的临床意义。１资料与方法１．１临床资料研究对象为２００７年１月一２００８年１２月在镇江市第四人民医院妇科初次接受手术治疗的宫颈癌患者５０例，年龄２８—６４岁、平均４６．１配制ＰＣＲ反应混合液，取３８皿加入ＰＣＲ反应管中，然后加２斗Ｌ待测ＤＮＡ样品。将待测反应管按顺序放人ＰＣＲ扩增仪（ＳＬＡＮｔｉｏｎ岁。均符合以下条件：①术前未经先期放、化疗及其他抗癌处理；②术后病理检查确认为宫颈癌；③在本院接受广泛全子宫切除加盆腔淋巴结清扫术；④ＦＩ．ＧＯ分期为ＩＡ～ⅡＢ期；⑤均为同一组手术医师按《ＦＩＧ０２００４年妇科恶性肿瘤诊断与治疗指南》进行Ｒｅａｌ．ＴｉｍｅＰＣＲＤｅｔｅｃ．ｃｙｃｌｅ５０℃，２ｓ＿÷Ｓｙｓｔｅｍ）中，扩增参数设置如下：１ｍｉｎ＿１ｃｙｃｌｅ９５℃，１０ｍｉｎ—４０ｃｙｃｌｅｓ：９５℃，１５５２℃，３０ｓ＿６２℃，１ｍｉｎ。每批均设ＨＰＶ阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照。１．２．２围术期处理及术式选择；⑥清扫的淋巴结进行了分组。术后病理检查证实１ｌ例（２２％）发生盆腔淋巴结转移。患者术前均已做宫颈脱落细胞ＨＰＶ—ＤＮＡＳＳＣＡ的检测患者术前取静脉血３ｍＬ，分离血清，在美国雅培公司的ＩＭＸ全自动免疫分析仪上，用微粒子酶免疫测定法作ＳＣＣＡ水平检测，ＳＣ．５５万方数据ＣＡ≤１．５斗昏／Ｌ为阴性，ＳＣＣＡ＞１．５¨ｇ／Ｌ为阳性。１．２．３统计学方法采用ＳＰＳＳｌ３．０统计软件，四格表资料比较用ｘ２检验。Ｐ≤０．０５为有统计学差异。２结果２。１宫颈癌患者盆腔淋巴结及宫颈原发部位ＨＰＶ—ＤＮＡ检测结果宫颈原发部位ＨＰＶ—ＤＮＡ检出率为９２．０％（４１／５０），盆腔淋巴结检出率为２８．０％（１４／５０）。本实验共检测病理阳性的淋巴结和阴性淋巴结１８５个，２３个病理诊断转移阳性的淋巴结（１１例）均检出ＨＰＶ—ＤＮＡ，占１００％，１６２个病理诊断转移阴性淋巴结１４个检出ＨＰＶ—ＤＮＡ，占８．６％；１１例病理诊断淋巴结转移阳性的患者宫颈原发部位均检出ＨＰＶ—ＤＮＡ，３９例病理诊断淋巴结转移阴性的患者，其中３例盆腔淋巴结与宫颈原发部位均检出ＨＰＶ．ＤＮＡ，占７．７％，其余３６例盆腔淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ检测均阴性，但宫颈原发部位３２例ＨＰＶ．ＤＮＡ检测阳性。２．２宫颈癌患者术前ＳＣＣＡ水平的检测结果３０例（６０％）患者ＳＣＣＡ＞１．５斗∥Ｌ，１０例患者ＳＣＣＡ＞４．０¨∥Ｌ，其淋巴结ＨＰｖ—ＤＮＡ均为阳性，其中９例患者病理诊断淋巴结转移阳性；２０例（４０％）患者ＳＣＣＡ＜１．５斗ｇ／Ｌ。与淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ相关性分析见表１。表１宫颈癌患者术前ＳＣＣＡ水平与淋巴结ＨＰＶ．ＤＮＡ的相关性分析＞１．５ｉ≥Ｌ９’４８１＜０．０５３０１４≤４．０ｕ∥Ｌ４０４＞４．ｏ＝：≥Ｌ２７．８３０＜０’０１ｌｏｔｏ２．３宫颈癌淋巴结转移高危因素的相关分析见表２。３讨论目前，国内外学者普遍认为高危型ＨＰＶ生殖道持续感染是宫颈癌及癌前病变发生发展的必要致病因素。大量的流行病学研究和分子生物学研究发现，９９．７％以上的宫颈癌有ＨＰＶ感染悼１。在女性ＨＰＶ感染者中只有大约１％发生宫颈癌，虽然比例比较小，但是世界范围内的宫颈癌发病率及宫颈癌相关病死率仍然相当高。在本实验中宫颈癌患者宫颈脱落细胞高危型ＨＰＶ感染率为９２％（４６／５０），略低于文献报道，可能与标本量及标本不是直接从癌组织中取材有关。宫颈感染ＨＰＶ后病毒整合到宿主ＤＮＡ中，经过一段时间才使宿主细胞发生恶变，ＨＰＶ的持续感染是病变的持续和进展的高危因素。５６万方数据出苤医麴２Ｑ！兰生箜墨兰鲞箜三三翅表２宫颈癌淋巴结转移高危因素的相关分析临床病理特征ｎ淋巴结转移（例）ｘ２Ｐ病程（月）≤３５＞３及凹Ｏ．００７＞０．９０６原发部位肿瘤大小（ｃｍ）≤４７＞Ｏ。７５）４”冯Ｏ、Ｑ５ｌ４临床分期Ⅱ期Ｏ・００５＞０・９０３０７淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ阳性１４１１阴性３１・８３０＜Ｏ・０ｌ３６０宫颈原发部位ＨＰＶ・ＤＮＡ阳性４６１１阴性Ｏ・２２９’０・５０４０术前ＳＣＣＡ水半≤１．５ＬＬ∥Ｉ，２００＞１．５：Ｌ≥Ｌ７．３８６（ｏ－０１３０ｌ【术前ＳＣＣＡ水平≤４．０Ⅲ矿Ｌ４０２＞４．ｏ≥Ｌ１０９２８．９１０＜０．０１病理分化程度高１７２中２５６２．２１６＞０．１０低８３深部浸润有２９７Ｏ・００７＞０・９０无２１４宫体侵把有１０８无４０２０・４６０３（０・０１阴道边缘浸润有９７无１６・１３０＜Ｏ＿Ｏｌ４１４因此可以根据ＨＰＶ感染的自然清除时间选择６—早期宫颈癌淋巴结转移是影响患者预后的重要因素，其关系到手术治疗后的选择。一般认为，手术临床中发现部分此类患者术后意外地出现复发或转通常情况下，ＨＰＶ—ＤＮＡ在宿主细胞中是游离状态，在某些条件下整合到宿主细胞基因组中，对细胞进行转化、永生化，进而得以长期存活并进一步发挥致癌作用。随着肿瘤扩散，整合在宿主细胞中的ＨＰＶ—ＤＮＡ在转移的病灶中理论上也是可以检测出来的。荧光定量ＰＣＲ采用ＰＣＲ核酸扩增结合荧光探针检测技术，通过荧光自动ＰＣＲ仪实现在全封闭反应体系中进行核酸扩增与检测，大大提高了检测１２个月为间隔检测是否为持续感染。成功而术后病理证实元淋巴结转移和残留病变的患者预后良好，没必要对其进行术后辅助治疗。然而，移，约占２０％∞’，提示可能存在组织学未能发现的转移。出丕医药兰Ｑ！至生箜至至鲞筮！！翅的灵敏度、特异性和准确性，并能确保石蜡包埋组织、甲醛固定标本中ＤＮＡ的检测Ｈ．５ｊ。本研究中所有病理诊断转移阳性的淋巴结均检出ＨＰＶ．ＤＮＡ，证实了检测方法的可靠性。实验中组织病理学淋巴结转移的１１例患者淋巴结ＨＰＶ．ＤＮＡ检测均为阳性（占１００％），较孙颖等Ｍ１的研究比例高，可能与检测的ＨＰＶ型别不同有关，他们仅测１６／１８型，而我们测１３种高危型。淋巴结转移高危因素有淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ阳性、术前ＳＣＣＡ水平、宫体浸润及阴道切缘浸润，进一步提示淋巴结转移与淋巴结ＨＰＶ－ＤＮＡ阳性密切相关。３９例病理诊断淋巴结转移阴性的患者中３例盆腔淋巴结检出ＨＰＶ—ＤＮＡ，占７．７％；１６２个病理诊断转移阴性淋巴结中，１４个检出ＨＰＶ—ＤＮＡ，占８．６％，较以往研究中病理诊断转移阴性淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ检出率１０％一５０％的结果低，可能与本实验标本量少有关。组织病理学淋巴结阴性而ＨＰＶ．ＤＮＡ检测阳性可能与３个因素有关：组织病理学未能发现的微转移、被免疫活性细胞吞噬消化的微转移灶、经过淋巴道运输扩散的游离ＨＰＶ病毒颗粒＂Ｊ。在３例组织病理学诊断淋巴结未转移而ＨＰＶ．ＤＮＡ阳性的患者中，有１例未做任何术后辅助治疗，１１个月后发生了肝转移，说明此患者的盆腔淋巴结髓质很可能存在少量癌细胞，但在常规病理切片中被遗漏，也可能在手术的同时存在不能发现的血液播散。盆腔淋巴结检出ＨＰＶ－ＤＮＡ阳性可能早于组织病理学出现转移。ＳＣＣＡ是鳞状上皮癌特异的一种肿瘤相关抗原。ＳＣＣＡ参与细胞凋亡的，其表达增加可以使癌细胞通过抑制细胞凋亡途径而对机体的几种细胞自杀机制产生抵抗性。ＳＣＣＡ是宫颈鳞癌相关的肿瘤标志物，治疗前血清ＳＣＣＡ水平升高和盆腔淋巴结转移是影响ＩＢ１～ⅡＡ期宫颈鳞癌患者预后的因素，治疗前血清ＳＣＣＡ水平升高且盆腔淋巴结无转移患者的局部复发风险显著升高呻’９１。本实验中术前血清ＳＣＣＡ按１．５灿ｇ／Ｌ及４．０ＩＸｇ／Ｌ两个水平和淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ阳性及淋巴结转移进行相关性分析，结果显示所有淋巴结ＨＰＶ－ＤＮＡ阳性和淋巴结转移的宫颈癌患者ＳＣＣＡ＞１．５ＩＸｇ／Ｌ，三者结果相关；而１０例患者ＳＣＣＡ＞４．０斗ｇ／Ｌ，其淋巴结ＨＰＶ—ＤＮＡ均为阳性，其中９例患者病理诊断淋巴结转移阳性，三者结果高度相关，提示当ＳＣＣＡ＞４．０汕ｇ／Ｌ时淋巴结转移的危险性大大增加，和Ｔａｋｅｓｈｉｍａ等¨叫在研究中发现ＳＣＣＡ＞４．０ｎｇ／ｍＬ者淋巴结转移的危险性较ＳＣＣＡ＜４．０ｎｇ／ｍＬ者增万方数据加８倍的结果相吻合。说明术前ＳＣＣＡ水平可以作为预测淋巴结转移及预后的一项辅助指标。总之，本研究结果表明，宫颈癌患者盆腔淋巴结高危型ＨＰＶ．ＤＮＡ阳性及术前血清ＳＣＣＡ水平与其淋巴结转移、预后密切相关。因此，对早期宫颈癌患者进行盆腔淋巴结高危型ＨＰＶ—ＤＮＡ定性定量分析和术前血清ＳＣＣＡ检测，可能对判断早期宫颈癌淋巴结转移及预后有指导意义，有助于临床对患者制定个体化治疗方案，最终提高早期宫颈癌患者的生存时间‘１１］。参考文献：［１］ＫａｍａｎｇａｒＦ，ＤｏｔｅｓＧＭ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＷＦ，ｅｔａ１．Ｐａｔｔｅｍｓｏｆｃａｎｃｅｒｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，ａｎｄｐｍｖａｌｅｎｅｅａｃｔｏ∞ｆｉｖｅｃｏｎｔｉｎｅｎｔｓ：ｄｅｆｉｎｉｎｇｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓｔｏｒｅｄｕｃｅｃａｎｃｅｒｄｉｓｐａｒｉｔｉｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｒｅｇｉｏｎｓｏｆｔｈｅｗｏｒｌｄ［Ｊ］．ＪＣｌｉｏｎＯｎｃｏｌ，２００６，２４（１４）：２１３％２１５０．［２］ＹｌｉｔａｌｏＮ，ＪｏｓｅｆｓｓｏｎＡ，ＭｅｌＩＩｙｅＭ，ｅｔａｌ。Ａｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｓｔｕｄｙｓｈｏｗ—ｉｎｇｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒａｓ１６ｂｅｆｏｒｅｔｈｅｄｅ—ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｉｎｓｉｔｕ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２０００，６０（２１）：６０２７－６０３２．［３］Ｓ１６ｍａＪ，Ｄｒａｚｄ６ｋｏｖ６Ｍ，Ｆｉｓｃｈｅｒｏｖ６Ｄ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨＰＶＤＮＡｉｎｌｙｍｐｈｎｏｄｅｓｉｎｅａｒｌｙｓｔａｇｅｓｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．ＣｅｓｋａＧｙ—ｎｅｋｏｌ，２００８，７３（４）：２１７－２２１．［４］ＳｈｉｂａｔａＤ，ＣｏｓｇｒｏｖｅＭ，ＡｍｈｅｉｍＮ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐａｐ—ｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＤＮＡｉｎｆｉｎｅ・・ｎｅｅｄｌｅａｓｐｉｒａｔｉｏｎｓｏｆｍｅｔａｓｔａｔｉｃｓｑｕａｍｏｕｓ－・ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｔｈｅｕｔｅｒｉｎｅｃｅｒｖｉｘｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈｉｎａｒｅａｃ—ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＤｉａｇｎＣｙｔｏｐａｔｈｏｌ。１９８９，５（１）：４０－４３．［５］ＳｉｒｉａｕｎｋｇｕｌＳ，Ｓｕｗｉｗａｔｓ，ｓｅｔｔａｋｏｍＳ，ｅｔａ１．ＨＰＶｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｉｎＮｏｎｈｅｍＴｈａｉｌａｎｄ：ａｄａｐｔｉｎｇｔｈｅｌｉｎｅａｒａｒｍｙＨＰＶａｓｓａｙｆｏｒｕｓｅｏｎｐａｉａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．ＧｙｎｅｃｏｉＯｎｃｏｌ，２００８，１０８（３）：５５５－５６０．［６］孙颖，刘国炳，余艳红，等．盆腔淋巴结ＨＰＶ－ＤＮＡ检测率与早期宫颈癌临床转移的关系［Ｊ］．南方医科大学学报，２００８，２８（５）：７９６－８０４．［７］ＣｈａｎＰＫ，ＹｕＭＭ，ＣｈｅｎｇＴＨ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＤＮＡｉｎｐｒｉｍａｒｙｔｕｍｏｕｒａｎｄｌｙｍｐｈｎｏｄｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｅａｒｌｙｓｔａｇｅｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＶｉｒｏｌ，２００５，３３（３）：２０１－２０５．［８］熊樱，梁立治，郑敏，等．鳞状细胞癌抗原与子宫颈鳞状细胞癌的ｌ临床病理特征及预后的关系［Ｊ］．中华妇产科杂志。２００７，４２（１）：２９－３３．［９］ＫｏｔｏｗｉｃｚＢ，ＦｕｋｓｉｅｗｉｃｚＭ，ＫｏｗａｌｓｋａＭ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｍ西ｏｎａｌｌｙｍｐｈｎｏｄｅｓｔａｔｕｓｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＩｎｃＪＧｙｎｅｅｏｌＣａｎｃｅｒ，２００８，１８（６）：１２７９—１２８４．［１０］ＴａｋｅｓｈｉｍａＮ，ＨｉｒａｉＹ，ＫａｔａｓｅＫ，ｅｔａｌ，Ｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｓｑｕａｍｏｕｓｅｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎａｓａｐｒｅｄｉｃｔｏｒｏｆｎｏｄａｌｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＧｙｎｅｃｏｌＯｎｃｏｌ，１９９８，６８（３）：２６３－２６６．［１１］燕玉风，盛修贵，杜雪莲，等．宫颈小细胞癌十例临床分析［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１１，１８（１６）：１２９３—１２９５．（收稿１３期：２０１２－０５－０９）５７
