微孢子虫DNA提取方法的比较

广东蚕业４０（３）：３２—３４　微孢子虫ＤＮＡ提取方法的比较　李夫涛　王彦文ｚ　（’广东省农科院蚕业与农产品加工研究所广州５３　０６３　０；　山东农业大学林学院）　摘要：本实验采用陈秀改进法、ＳＤＳ法、ＣＴＡＢ法和ＴＥＫ改进法对四种微孢子虫　ＳＤ、、ＳＤ，、ＳＤ　、ＳＤ　基因组ＤＮＡ进行抽提，并对抽提效果做了对比，结果表明，　陈秀改进法对ＳＤ　、ＳＤ　、ＳＤ　基因组ＤＮＡ抽提效果较好，ＴＥＫ改进法对ＳＤ：、　ＳＤ　、ＳＤ　基因组ＤＮＡ抽提效果较好，ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法对四种微孢子虫基因组　ＤＮＡ的抽提效果均不理想，　关键词：家蚕微孢子虫ＤＮＡ　家蚕微粒子病是由家蚕微粒子　（Ｎｏｓｅｍａ　ｂｏｍｂｙｃｉｓ，简称Ｎ．ｈ．）引起的一　于上海生工）。　１．２实验方法　种危害非常严重的传染性病害，曾给欧洲　蚕业带来毁灭性打击。微孢子虫被认为是　利用４种常规的昆虫微孢子虫ＤＮＡ　提取方法对家蚕微孢子虫ＤＮＡ进行抽提，　与生物的进化有关的最原始的真核生物，　因此对微孢子虫分子生物学的研究具有重　要的生物学意义和经济意义。由于微孢子　比较不同方法的抽提效果。　２实验结果　虫具有一层几丁质外壳，对一般的化学物　质和不良环境有很强的抵抗性，常规的　２　１陈秀改进法对四种家蚕微孢子　虫ＤＮＡ的提取效果　ＤＮＡ抽提法不适用于微孢子虫。为获得　其ＤＮＡ，通常先对微孢子虫进行“发芽”　处理，使微孢子虫弹出极丝、释放孢原　陈秀对Ｎ．ｂ．、桑尺蠖微孢子虫进行　ＤＮＡ提取．其方法是先让孢子发芽，然　后用常规酚／氯仿法抽提ＤＮＡ，被认为　质，然后再进行常规酚／氯仿抽提ＤＮＡ，　可获得较好的抽提效果…。　１材料与方法　１．１材料　是较优的抽提方法。本实验对其方法进行　改进：在离心后的孢子中加入０．５ｍｌ　０．２ｍｏｌ／Ｌ　Ｋ　ＣＯ，，移于２５　水浴锅中水浴　１小时，离心去上清后加ｐＨ７．８　ＰＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　（２５０ｍｌ：　２ｇ　ＮａＣ１。０．０５ｇ　ＫＣ１．　０．３６ｇ　４种家蚕分离的微孢子虫ＳＤ　、ＳＤ　、　Ｎａ２ＨＰＯ４，０．０６ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．８）０．５ｍｌ，　ｓＤ　、ｓＤ　均是从山东各地收集，山东农　业大学蚕病室保存。ＰＢ　Ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒ、氯仿：异戊醇（２４：１）、ＳＤＳ、　ＣＴＡＢ、ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、入ＤＮＡ／ｈｉｎｄⅢ、　移于２５　水浴锅中水浴１小时以上，然　后进行常规的酚／氯仿法抽提ＤＮＡ，将　抽提到的样品电泳，紫外灯下观察电泳结　果：ＳＤ　、ＳＤ：、ＳＤ，均出现了一条明显的电　泳条带，当对ＳＤ　的效果较差。（如图１）。　０．８％ａｇｒｏｓｅ、２０ｍｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ（药品购　维普资讯 http://www.cqvip.com

微孢子虫ＤＮＡ提取方法的比较　３３　图ｌ　陈秀改进法提取微孢子虫ＤＮＡ电　泳图　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　１：ＳＤｊ　２：ＳＤ２　３：ＳＤ３　４：ＳＩ）４　２．２　ＳＤＳ法Ｉ　２ｌ对四种家蚕微孢子虫　ＤＮＡ的提取效果。　在接近家蚕中肠液ｐＨ值的温和条件　下，通过孢子发芽刺激处理液使孢子弹　极丝，释放原生质体，然后用常规的酚／　氯仿抽提法进行抽提，即可获得微孢子虫　ＤＮＡ。具体方法：在离心后的孢子液中加　人４００　ｌ抽提缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ的　Ｎａ２ＣＯ３，０．１５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１，ｐＨ１０．８），冰　浴３０分钟，加适量ｐＨ值４．８～５．２的　３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡｃ，调ｐＨ至８．０，加ＳＤＳ至　终浓度为０．５％，继续冰浴ｌ５分钟，转移　至５０　水浴锅中过夜，进行常规的酚／　氯仿法抽提ＤＮＡ。将抽提到的样品电泳，　紫外灯下观察电泳结果如图２所示：只有　ＳＤ，、ＳＤ　分别出现了一条不太清析的电　泳条带。　ｒ　１　２　４　图２　ＳＤＳ法提取微孢子虫ＤＮＡ电泳图　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　１：ＳＤｉ　２：ＳＤ２　３：ＳＤ３　４：ＳＤ４　２－３　ＣＴＡＢ法对家蚕微孢子虫ＤＮＡ的　提取效果　通过研磨法破坏孢子的几丁质外壳，　使原生质体暴露，然后用蛋白酶Ｋ酶解，　再用常规酚／氯仿法抽提。具体方法如　下：离心后的Ｎ．ｂ．孢子沉淀用ＣＴＡＢ溶液　４００　ｌ重悬，用干净的灭过菌的玻璃棒　研磨２～３分钟，加蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍ１）　约２０　１，然后在振荡器上振荡２０～３０秒，　５５￣Ｃ的水浴锅中保温４小时以上，酶消化　后的抽提液不经离心，待其冷却至室温　后，直接加３０　１氯仿，在振荡器上混　匀，然后１２０００转／分离心ｌ０分钟，进　行常规酚／氯仿法抽提ＤＮＡ。将抽提到　的样品电泳，紫外灯下观察电泳结果如图　３所示：ＳＤｌ、ＳＤ２、ＳＤ３出现了隐约可见　的电泳条带。　１　４　图３　ＣＴＡＢ法提取微孢子虫ＤＮＡ电泳图　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　ｌ：ＳＤｌ　２：ＳＤ２　３：ＳＤ３　４：ＳＤ４　２．４　ＴＥＫ改进法１　时家蚕微孢子虫进　行ＤＮＡ提取　孢子经过长时间的强碱的消解作用，　破坏几丁质外壳，然后用蛋白酶Ｋ酶解，　再用常规酚／氯仿法抽提。具体方法如　下：取ｌｍｌ孢子液（约１０８粒），加人　０．１ｍｌ，２ｍｏｌ／Ｌ的ＫＯＨ，置于２７℃的水浴　锅中保温１小时以上，加ｌｍｌ　ＴＥＫ缓冲　液（ＴＥＫ：ｈｎｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，０．１７ｍｏｌ／Ｌ　ＫＣ１，ｐＨ８．０），让其发　芽２小时。用适量的ＨＣ１凋ｐＨ至８．０，　维普资讯 http://www.cqvip.com

３４　广东蚕业　第４０卷　加５％ＳＤＳ至终浓度为０．５％，冰浴ｌ５分　钟。加入蛋白酶Ｋ至终浓度为０．５ｍｇ／ｍｌ　后转移至５０￣（２水浴锅中保温４　ｓｌｑｔ￣，以上，　进行常规的酚／氯仿法抽提ＤＮＡ。将抽　提到的样品电泳，紫外灯下观察电泳结果　如图４所示：ＳＤ　、ＳＤ　、ＳＤ　均出现了一　条明显的电泳条带。　图４　ＴＥＫ改进法提取微孢子虫ＤＮＡ电　泳图　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　１：ＳＤ１　２：ＳＤ２　３：ＳＤ３　４：ＳＤ４　３结论与分析　从实验方法的简便性和易用性来讲，　ＳＤＳ法和ＴＥＫ法都需要对ｐＨ值进行调　节，而因抽提样品的量小，不宜使用ｐＨ　计，只能用ｐＨ试纸来判断ｐＨ值，使操　作的准确性降低，可能会导致所提效果不　理想。ＣＴＡＢ法是通过研磨来破坏外壁，　因此研磨的效果就成了ＤＮＡ抽提成败的　关键。　实验结果表明，陈秀改进法和ＴＥＫ　改进法对微孢子虫ＤＮＡ提取效果较佳，　但陈秀改进法对ＳＤ　提取效果和ＴＥＫ改　进法对ＳＤ。提取效果不太好，这可能与不　同种类微孢子虫的结构和组成的多样性有　关　，造成其发芽条件的差异１５｝。因此，　不同种类微孢子虫即使在相同条件下，其　ＤＮＡ获得量也有较大差异。潘敏慧嘲在　ＤＮＡ制备的研究中认为陈秀方法只是针　对Ｎｏｓｅｍａ属微孢子的提取效果好但对于　小型微孢子虫ＳＣＭ７（Ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ　ｂｏｒｎ—　ｂｙｃｉｓ）ＤＮＡ的提取不太理想，容易引起　小型微孢子虫ＳＣＭ　基因组ＤＮＡ的断裂，　对进一步的试验和研究极为不利，而潘敏　慧的ＴＥＫ法不仅适用于Ｎｏｓｅｍａ属微孢子　ＤＮＡ提取，而且适合于小型微孢子虫　ＤＮＡ制备。　参考文献　１．陈秀，黄可威等，家蚕微粒子病的　ＰＣＲ诊断技术（Ｊ）．蚕业科学，１９９６，２２（４）：　２３１～２３４　２．家蚕微孢子虫孢子ＤＮＡ的提取，　克隆及部分ＤＮＡ序列分析（Ｉ）．蚕业科学，　１９９５，２１（２）：９１～９４　３．高永珍，戴祝芽，黄可威，等．家蚕病　原性微孢子虫的蛋白质化学性质的研究　Ｏ）．蚕业科学，１９９９，２５（２）：８２～９１　４．高永珍，黄可威．家蚕病原性微孢子　虫的超微结构研究（『）．蚕业科学，１９９９，２５（３）：　１６３～１６９　５．贡成良，早坂昭二．微孢子虫的发芽　及对细胞的感染一Ｉｔ（１）．蚕业科学，１９９９，２５（４）：　２１３～２１６　６．潘敏慧，万泳继，鲁成．不同种类微孢　子虫ＤＮＡ制备方法的研究（Ｉ）．西南农业大　学学报，２００１，２３（４）：１１４～１１６