生物工艺学习题

1、代谢控制的类型有几种？

主要类型1.酶活的调节（活化或钝化）2.酶合成的调节（诱导或阻遏）

微生物采用3种方式调节其初级代谢：酶活的调节、酶合成的调节和遗传控制。 2、酶合成调节与酶活调节异同之处是什么？ 酶合成的调节与酶活性的调节的对比

酶合成的调节 通过酶量的变化控制代谢速率 相对缓慢 基因水平调节，调节控制酶合成 酶活性的调节 控制酶活性，不涉及酶量变化 快速、精细 代谢调节，它调节酶活性 调节对象 不同点 相同点

调节效果 调节机制 细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。 3、简述诱导作用的机制。 （1）酶的诱导可分两种：

当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成；主要存在于短的代谢途径中。

如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、 -半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶；不管诱导强度如何，所以这三种蛋白以同一比例合成。（因为三者的基因组成同一操纵子） 2）顺序诱导

先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。 （2）酶的诱导机制：(以E.coli乳糖操纵子为例)

E.coli乳糖操纵子由lac启动基因(lacP)、lac操纵基因(lacO)和三个结构基因(lacZ、Y、A)所组成，三个结构基因分别编码-半乳糖苷酶、透过酶和转乙酰酶。

乳糖操纵子是负调节的代表，在缺乏乳糖等诱导物时，由调节基因(lacI)编码的调节蛋白（即lac阻遏物）一直结合在操纵基因上，抑制着结构基因转录的进行。 4、反馈调节有几种主要类型？简述其机制。 反馈调节分为：1.反馈抑制2. 反馈阻遏

1.反馈抑制: 是末端代谢产物抑制其合成途径中参与前几步反应的酶（通常是催化第一步反应酶）活性的作用。2.反馈阻遏:是末端代谢产物阻止整个代谢途径酶的合成作用

两种机制都起着调节代谢途径末端产物的生产速率的作用，以适应细胞中大分子合成对前体的需要。末端代谢产物阻遏作用的功能直接影响酶的合成速率，但如果其单独起作用，代谢还会继续，直至先前存在的酶随着细胞的生长而被稀释为止；末端代谢产物抑制作用可弥补这种不足，使某一代谢途径的运行立即中止。两者相辅相成，联合作用可使细胞生物合成途径达到高效调节。

末端产物阻遏 指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。

对直线式途径来说，末端产物阻遏的情况较简单，即产物作用于代谢途径中的各种关键酶，使之合成受阻； 对于分支代谢途径而言，情况较复杂，每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏（多价阻遏作用）。 末端产物(反馈)阻遏机制: (以色氨酸操纵子为例) 色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例

1

E.coli色氨酸操纵子也由启动基因、操纵基因和结构基因（5个）三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成途径中的5种酶。

调节基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白；其为由4个亚基组成的四聚体；单独的四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体的分子构象才能与trpO结合。

当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录（色氨酸为辅阻遏物）。

当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则导致阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因的转录又可正常进行。

5、如何改变培养环境条件来末端代谢产物在细胞内部的积累？ （1）控制培养基成分

 培养基成分对于受末端代谢产物阻遏的酶的生产是极其重要的。为此，应使培养液中尽量少含阻遏性化

合物，不含可导致胞内形成大量阻遏物的养分，通过末端产物在细胞内的积累可提高酶的产量。  如某些分解代谢酶（蛋白酶）活性受氨基酸或最终产物（NH3)的阻遏，故许多杆菌在含有一些氨基酸的

培养基内几乎不产生蛋白酶。

（2）加入生物合成途径的抑制剂（3）补给营养缺陷型突变株所需的生长因子（4）采用末端代谢产物的衍生物一般情况下为了增加一些受末端代谢阻遏的酶的产量，可采用补料方法，也就用一种仅能被生产菌生产菌缓慢利用的末端代谢产物的衍生物。

例如，用S-亚甲基胱氨酸可促进半胱氨酸营养缺陷型突变株的硫酸盐还原酶的生产。还有一种解除生物合成阻遏作用的方法是使用一种部分营养缺陷型菌株“泄漏”突变株。例如：将一种嘧啶部分营养缺陷型菌株培养在最低培养基中可使天冬氨酸转氨酸转氨甲酰酶的产量增产500倍。

第6章 培养基

1、培养基的碳源、氮源主要包括哪些物质

微生物利用的碳源物质主要有糖类、脂类、有机酸和低碳醇等。 工业常用的碳源：

 葡萄糖：是碳源中最易利用的糖。几乎所有微生物都可 利用。  乳糖： 纯乳糖、乳清粉

 淀粉：大麦、大米、燕麦粉、黑麦粉、玉米、野生植物、薯类等  蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖

 另外还有醋酸、乙醇、亚硫酸纸浆废液、食品工厂的下脚料等等。

有机氮（花生、黄豆、棉子）饼粉 玉米浆、玉米蛋白粉 蛋白胨(酵母、鱼、蚕蛹)粉 尿素 无机氮 氨水 铵盐 盐 N2 2、培养基的营养要素有哪些？

碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子、水。

3、什么是培养基？有什么作用？常用培养基类型有哪些？配制培养基时应主要考虑哪些因素？ 人工配制的适合微生物或其它细胞生长繁殖或产生代谢产物所需要的营养物质和原料。其作用提供营养和提供必要的生长环境。

1、按培养基成分：1）合成培养基2）天然培养基3）半合成培养基 2、按物理状态分：1）固体培养基2）半固体培养基3）液体培养基 3、按用途不同划分：1）孢子培养基2） 种子培养基3）发酵培养基

 考虑的因素：第一，考虑碳源、氮源时，要注意快速利用有碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互

配合，发挥各自的优势，避其所短。

 第二，选用适当的碳氮比。一般碳源用量比氮多。

 第三，要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。保证在发酵过程中pH能维持在最佳状态。 4、葡萄糖是较易被利用的碳源，培养基中葡萄糖过多时会产生哪些危害？

碳源过多，则容易形成较低的pH，另外碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。碳源过多，会引起微生物生长过于旺盛，而不利于产物的积累。但是过多的葡萄糖会过份加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中音代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。

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5、利用淀粉作为主要碳源，有什么好处？ 淀粉在发酵工业中被普遍使用，因为它利用可克服葡萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富，价格也比较低廉。 6、利用脂类作为碳源，对生产工艺的控制有什么特殊要求？

在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解成甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和水，并释放出大量的能量。因此，当微生物利用脂肪作碳源时， 要供给比糖代谢更多的氧，不然大量脂肪酸和代谢中的有机酸积累，会引起培养液pH下降，并影响微生物酶系统的作用。常用的油有豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉子油等。

7、什么是生理酸性物质和生理碱性物质？

生理酸性物质：如(NH4)2SO4为氮源时，由于NH4+被吸收，而造成培养基pＨ降低。 （NH4)2SO4 → 2NH3 + H2SO4

生理碱性物质：如以NaNO3为氮源时，由于根被利用，会引起培养基pＨ值的升高。 NaNO3+ 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH

第8章 培养技术与过程建模

1、Monod方程与米氏方程有何不同？

实际上，莫诺方程是在如下的假设基础上建立起来的： ①菌体生长为均衡型非结构式生长（只有数量的增长），因此，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示即可； ②培养基中只有一种基质是生长性底物，其他营养成分不影响微生物生长； ③将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。

Monod方程与酶催化反应的米氏方程形式一样，但Monod方程完全是经验的，而米氏方程则是推导出来的。 应当指出，该方程只适用于单基质及不存在抑制性基质的情况，即除了被试验的一种生长基质外，其它必需营养基质都是过量的，但这种过量又不致造成生长的抑制。

当存在抑制剂或在培养基中有混合基质时，用修改后的Monod方程才能符合实验数据。

2、影响停滞期长短的决定因素有哪些？

种子的活性、接种量、培养基的可利用性和浓度。

3、微生物生长可分为几个阶段？次级代谢产物通常在什么阶段开始合成？

微生物生长可分为停滞(延迟)期、对数生长期、减速期、静止（稳定）期和死亡（衰亡）期等阶段，在静止期（稳定期）菌体次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化。 4、发酵操作方式可分为几种，试述各种培养方式的优缺点。为什么连续培养不能无限期地连续下去，请简述之？

1.分批培养的优点：但由于操作相对较易，染菌机会少。目前仍是发酵工业的主要方式

缺点： 效率低；尽管微生物的活性和机能因其所处的环境大幅度变化，也根本不控制培养基组分浓度等环境因素，而任其自然变化，这样不利于生产；在每一批主反应（生产阶段）之前，必须进行几级种子培养。

2.补料－分批培养优点：在发酵系统中维持较低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。

缺点：一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，过高的底物浓度会抑制菌体的生长。在一些发酵过程中，加入前体可使产物的生产大大增加；但许多前体对菌体有毒性；一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时须补充其不能合成的物质供生产所需；但这些物质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作用，影响产物的合成。以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；

3.半连续培养优点：不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，有利于产物的继续合成。不足之处：①放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体。②定期补充和带放会使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体体积更大。③发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终发酵产物的合成。④一些经代谢产生的前体可能丢失。⑤有利于非产生菌突变株的生长。

4连续培养的优点：1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量，只保持一个期的稳定状态。2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。

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连续培养存在的问题：1）菌种的变异2）实际运行时间3）反应器传质能力，连续发酵对设备的密封性、培养液和空气的无菌度要求严格，目前使用的空气过滤器不能完全保证（长时间）100%的除菌效率4）丝状菌丝的阻塞，加入连续发酵罐的培养基与罐内发酵液的混合不均匀，即均匀度不够，就会使罐内各部分的微生物生长不一致，某部分微生物得不到充分的营养而引起操作不确定并降低产率。对于高黏度发酵液均匀度不够的情况更为严重。 5、分批培养中，各时期的细胞生长动力学特征是什么？

1、停滞(延迟)期：是微生物细胞适应新环境的过程。2、对数生长期 ：这一时期，培养基营养物质丰富，有毒代谢物少，细胞的生长不受，因此细胞浓度随培养时间呈指数增长，细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比，比生长速率μ与微生物种类、培养温度、pH、培养基成分及性基质浓度等因素有关。在对数生长阶段，细胞的生长不受，因此比生长速率达到最大值μm。3、减速期：对数期后，培养基营养物质大量消耗，有害物质逐渐积累，细胞的比生长速率下降，进入减速期。当培养基中不存在抑制细胞生长物质时，细胞的比生长速率和性基质的浓度S有如下关系：

4、静止期（稳定期）：特点：细胞浓度达到最大，细胞增加速度与死亡速率相等 。 5、衰亡期：特点：1）微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽，细胞开始在自身所含的酶的作用下死亡（自溶）。

dX2）细胞死亡速率大于比生长速率。α > µ 0dt6、补料分批培养与连续发酵过程的主要动力学特征各是什么？准稳态与稳态的区别主要在哪里？

dsdx 0,0,,Ddtdt补料分批培养： 只进不出，直到培养液到定额为止；与连续培养不同，在该法培养中， μ、D随着培养时间的延长，由于体积的增加，μ和D以相同速度下降，而连续培养中，μ和D为定值。 连续发酵：连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速

dxdsdp增微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。 D,0,0,0dtdtdt补料分批培养：在基础培养基营养消耗完时，开始补料，随着营养的添加，一方面菌体增殖而增加菌体浓度；另一方面，发酵液体积增加又使菌体浓度被稀释；两方面的趋势最终接**衡，这种状态称为“准恒定状态”。 连续发酵：指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的液量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态（基质浓度、产物浓度、pH、菌体浓度、比生长速率）下生长的微生物培养方式。

7．什么是菌体的比生长速率、产物的比形成速率以及比基质的消耗速率？什么是倍增时间、得率系数 ？ 1dx比速率:单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量。细胞生长的比速率为： xdt产物的比形成速率：单位质量细胞在单位时间生成产物的量。基质的消耗速率：生成的细胞量与底物消耗量之比，为对底物消耗得率。 得率：是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。得率系数Y: 两种物质得失之间的计量比。倍增时间(td) ：微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，也叫增代时间. 8为什么说微生物分批培养是一种非稳态的过程？

分批培养中，由于底物的不断消耗和产物的积累，反应器内细胞所处的环境也随之不断变化，反应过程处于非稳定状态操作，并且某些反应产物可能存在对反应抑制作用，细胞不能始终在最优条件进行，致使随着反应过程的进行，分批反应效率逐渐降低。

2、填空 微生物在一个密闭系统中的生长情况：

dX

dX延迟期： （ 0 ） 对数生长期: µ ( = ) µmax 静止期： dt （ 0 ）x=xmas dt

衰亡期:

dX dt ＜（ 0 ）

第10章酶与细胞的固定化技术及应用

1、酶活性中心不易被破坏、酶高级结构变化少的酶固定化方法是[ D ]

• A .共价结合法和交联法 B. 物理吸附法和交联法 • C. 离子结合法和共价结合法 D.物理吸附法和离子结合法 2. [ B ] 固定化酶活力的测定方法有

• A、间歇（分批）测定法

• B、间歇（分批）测定法和连续测定法 • C、续测定法 D、化学测定法

4

3. 现在固定化酶的物理性状不包括哪类：[ C ]

• A、酶膜、酶管 B、酶纤维、 C、溶酶体 D、微囊、颗粒状 4. 天然酶使用后通常[ B ] 。

• A、不回收，能连续使用 B、不回收，不能连续使用 • C、回收，能连续使用 D、回收，不能连续使用 5. 包埋法的固定化酶只适用于[ A ]转化反应，

• A、小分子低物及小分子产物的 B、 催化大分子低物和大分子产物反应 • C、小分子低物和大分子产物反应 D、催化大分子低物和小分子产物反应 6. [ B ] 天然酶经固定化后即成为固定化酶，其催化体系为：

• A、均相反应 B、非均相反应。 C、不确定 D、两种都有 7. 酶固定化后其反应最适pH [ A ]

A、可能变大，也可能变小。 B、变大 C、变小 D、不变 8. [ B ]包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可以分为：

• A、凝胶包埋法和离子结合法 B、网格型和微囊型 • C、共价结合法和吸附法 D、载体结合法和无载体法 9. [ A ]判断酶固定化方法优劣的指标是

• A、偶联率及固定化酶活力 B、固定化酶活力 • C、偶联率 D、天然酶比活率 10. [ ABC ]按固定的细胞类型不同分为三类：

• A、微生物 B、动物； C、植物； D、病毒

11章

1、典型的蛋白质组学研究常分为哪几个步骤？

1．从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液 .2。分离蛋白质混合液 3。将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析 4。将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析 2、在蛋白质分离中，凝胶技术和非凝胶技术各指的是哪些技术？各有什么特点？

凝胶技术 二维（双向）凝胶电泳 特点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性

非凝胶技术 高效液相色谱法 毛细管电泳 液相等点聚焦和毛细管色谱 特点 自动化程度高、分辨率高，检测限低。

3、什么是生物质谱、软电离？如何应用生物质谱鉴定蛋白质？

质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量 如何应用生物质谱鉴定蛋白质

肽质量指纹谱 串联质谱的肽序列标签 肽段的从头测序

4、目前常用的蛋白质定量方法有哪几种？它们的基本原理是怎样的？ 1、基于荧光染色技术的电泳定量法 2、基于稳定同位素技术的质谱定量法 1、基于荧光染色技术的电泳定量法 p207

2.同位素标记法基本原理： 将待比较的一对肽段样品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标记和未标记肽段的相对丰度。

1、名词解释：原代培养、传代培养、有限细胞系、连续细胞系、细胞株、细胞冻存、细胞复苏。 答：原代培养：是指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段,一般持续1~4周。

传代培养：由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限增殖能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。

有限细胞系：不能继续传代或传代次数有限。 连续细胞系：可以连续传代。

细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系，用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞

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群。

细胞冻存：用冷冻保护液将细胞预冷，稀释成2×10～5×10cells/ml的细胞液，置于冷冻管中，以一定

66的降温速率逐步降低其温度，然后放入低温冰柜或液氮中保存，之一过程称为细胞冻存。 细胞复苏：当需要进行细胞培养时，以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程，称之为细胞复苏。 2、冻存保护剂分哪几类？各有什么特点？ 答：可分为渗透型和非渗透型两类。

渗透型冻存保护剂的特点：易与水分子结合，易穿透细胞膜进入细胞内部，从而降低细胞冰点，提高细胞质膜对水的通透性；冻存时，保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外，从而减少胞内冰晶的形成；复苏时，促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤。甘油、二甲亚砜是最常见的渗透性保护剂。 非渗透型冻存剂的特点：一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内部，但能溶于水，可稀释细胞外电解质的浓度，从而减少溶质损伤；这些大分子物质可结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞外冰晶的形成。主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖等。

3、细胞低温保存存活率与冷却速率有何关系？

答：对于某一种细胞和某一确定的保存方案，对应最大的细胞存活率，确实存在着某种最佳冷却速率；而过快或过慢的冷却速率都会导致细胞受到损失，降低其存活率。 3、动物细胞培养基分为几类？各有何优缺点？ 答：（—）天然培养基

优点：营养价值高。

缺点：成分复杂，来源有限。 （二）合成培养基

优点：合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。

缺点：与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。 （三）无血清培养基

4、动物细胞培养生物反应器主要有哪些？各有何特点？

答：1、机械搅拌式生物反应器:是最传统的微生物发酵装置,也可以用于动物细胞悬浮培养.

2、气升式生物反应器：利用通入反应器的无菌空气的上升气流带动培养液进行循环，使供氧和混合两种作用融为一体的一类生物反应器。

3、填充床生物反应器：填充床生物反应器是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞生长。营养液通过循环灌注的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。

4、 中心灌流式反应器：反应器为一多孔状管道，称为分配管。分配管的外周包围着多层与其平行排列的中空纤维。

5、波浪袋生物反应器：波浪袋生物反应器不同于其它生物反应器，其培养规模最大可达到100L，并可随意替换无菌培养袋。

波浪袋生物反应器不是通过透气膜进行氧的传输，氧的传输以及氧与培养基的混合通过一个特殊的摇动装置产生波浪来实现。这种波浪活动并不产生气泡，通过波浪产生的表面与反应器顶部空气的接触进行氧的交换，同样将悬浮的细胞、微粒以及培养液进行混匀。

6、 旋转式培养系统：优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。

缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受。

5、昆虫细胞培养和哺乳动物细胞培养的主要区别在哪？昆虫细胞用培养基有什么独特性？

答：昆虫细胞培养和哺乳动物培养在主要原理和方法上是相似的，主要的区别就在于所使用的培养基。 昆虫细胞用培养基偏酸性。在pH6.2~6.9内，培养基用磷酸钠作缓冲体系，无需CO2.

渗透压高。一般培养昆虫细胞的培养基的渗透压为340~390mOsmol/kg,而哺乳动物细胞用的培养基

6

的渗透压为290~330mOsmol/kg。

尽管培养基内的无机盐成分类似，不同的昆虫细胞所用的基础培养基内Na+/K+不同。

13章

1、植物细胞培养基由几大类组成？各有何作用？

（1）无机成分：N、P、K、Ca、S等浓度大于0.5mmol／L大量元素及Fe，B，Mn，Cu等浓度小于0.5mmol／L微

量元素。 （2）有机成分

①含N物质：包括维生素和氨基酸等 ②碳源：2%—5%的葡萄糖或蔗糖

③植物激素：生长素，细胞素和赤霉素等

④天然复合物：水解蛋白类、酿酒副产品、胚乳液、果汁 （3）抗生素：一般情况下避免添加

（4）凝胶成分：琼脂、琼脂糖、藻酸盐等，起支持作用

2、以MS培养基为例，如何配制植物细胞培养基？应注意什么问题？

溶化琼脂（600-700ml）

加蔗糖

溶解 液 调pH（5.8） 定容（1L） 分装 包扎及灭菌

母液的量取

混合

3、提高次生代谢产物的途径有哪些？举例说明。

一）筛选得到高产细胞系（株） 二）培养条件 （培养基成分 光 温度 ph 通气量和搅拌转速 前体饲喂 诱导子的应用）三）毛状根培养技术 （四）、冠瘿培养技术 4、提高次生代谢产物的技术有哪些？举例说明。

1 、两步法培养技术 2、 两相培养技术 3、固定化培养技术

5、什么是植物次生代谢产物？一般分为几大类？

次级代谢产物 是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，并非细胞生长所必需的。如生物碱、黄酮、挥发油、皂甙等。

植物次生代谢物一般分为酚性化合物、萜类化合物、含氮有机物三大类。

6、植物细胞生物反应器的选型应考虑哪些方面？

7、名词解释：外植体、愈伤组织、继代培养、次生代谢产物、诱导子、毛状根、冠瘿组织 习惯上把用作细胞培养的材料称为外植体（在原生长部位取得并转移到培养基上生长的组织块

继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。

脱分化后的细胞经过细胞，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之愈伤组织（callus)

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次级代谢产物 是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，并非细胞生长所必需的。如生物碱、黄酮、挥发油、皂甙等。 毛状根 是发根农杆菌感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。 冠瘿组织

冠瘿组织 利用根癌农杆菌感染植物可将其Ti质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导植物细胞产生冠瘿组织的发生

11章

1、典型的蛋白质组学研究常分为哪几个步骤？

1．从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液 .2。分离蛋白质混合液 3。将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析 4。将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析 2、在蛋白质分离中，凝胶技术和非凝胶技术各指的是哪些技术？各有什么特点？

凝胶技术 二维（双向）凝胶电泳 特点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性

非凝胶技术 高效液相色谱法 毛细管电泳 液相等点聚焦和毛细管色谱 特点 自动化程度高、分辨率高，检测限低。

3、什么是生物质谱、软电离？如何应用生物质谱鉴定蛋白质？

质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量 如何应用生物质谱鉴定蛋白质

肽质量指纹谱 串联质谱的肽序列标签 肽段的从头测序

4、目前常用的蛋白质定量方法有哪几种？它们的基本原理是怎样的？ 1、基于荧光染色技术的电泳定量法 2、基于稳定同位素技术的质谱定量法 1、基于荧光染色技术的电泳定量法 p207

2.同位素标记法基本原理： 将待比较的一对肽段样品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标记和未标记肽段的相对丰度。

1、名词解释：原代培养、传代培养、有限细胞系、连续细胞系、细胞株、细胞冻存、细胞复苏。 答：原代培养：是指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段,一般持续1~4周。

传代培养：由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限增殖能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。

有限细胞系：不能继续传代或传代次数有限。 连续细胞系：可以连续传代。

细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系，用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。

细胞冻存：用冷冻保护液将细胞预冷，稀释成2×10～5×10cells/ml的细胞液，置于冷冻管中，以一定的降温速率逐步降低其温度，然后放入低温冰柜或液氮中保存，之一过程称为细胞冻存。 细胞复苏：当需要进行细胞培养时，以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程，称之为细胞复苏。 2、冻存保护剂分哪几类？各有什么特点？ 答：可分为渗透型和非渗透型两类。

渗透型冻存保护剂的特点：易与水分子结合，易穿透细胞膜进入细胞内部，从而降低细胞冰点，提高细胞质膜对水的通透性；冻存时，保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外，从而减少胞内冰晶的形成；复苏时，促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤。甘油、二甲亚砜是最常见的渗透性保护剂。 非渗透型冻存剂的特点：一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内部，但能溶于水，可稀释细胞外电解质的浓度，从而减少溶质损伤；这些大分子物质可结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞外冰晶的形成。主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖等。 3、细胞低温保存存活率与冷却速率有何关系？

答：对于某一种细胞和某一确定的保存方案，对应最大的细胞存活率，确实存在着某种最佳冷却速率；

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66而过快或过慢的冷却速率都会导致细胞受到损失，降低其存活率。 3、动物细胞培养基分为几类？各有何优缺点？ 答：（—）天然培养基 优点：营养价值高 缺点：成分复杂，来源有限。 （二）合成培养基

优点：合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。

缺点：与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。 （三）无血清培养基

4、动物细胞培养生物反应器主要有哪些？各有何特点？

答：1、机械搅拌式生物反应器:是最传统的微生物发酵装置,也可以用于动物细胞悬浮培养.

2、气升式生物反应器：利用通入反应器的无菌空气的上升气流带动培养液进行循环，使供氧和混合两种作用融为一体的一类生物反应器。

3、填充床生物反应器：填充床生物反应器是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞生长。营养液通过循环灌注的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。

4、 中心灌流式反应器：反应器为一多孔状管道，称为分配管。分配管的外周包围着多层与其平行排列的中空纤维。

5、波浪袋生物反应器：波浪袋生物反应器不同于其它生物反应器，其培养规模最大可达到100L，并可随意替换无菌培养袋。

波浪袋生物反应器不是通过透气膜进行氧的传输，氧的传输以及氧与培养基的混合通过一个特殊的摇动装置产生波浪来实现。这种波浪活动并不产生气泡，通过波浪产生的表面与反应器顶部空气的接触进行氧的交换，同样将悬浮的细胞、微粒以及培养液进行混匀。

6、 旋转式培养系统：优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。

缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受。

5、昆虫细胞培养和哺乳动物细胞培养的主要区别在哪？昆虫细胞用培养基有什么独特性？

答：昆虫细胞培养和哺乳动物培养在主要原理和方法上是相似的，主要的区别就在于所使用的培养基。 昆虫细胞用培养基偏酸性。在pH6.2~6.9内，培养基用磷酸钠作缓冲体系，无需CO2.

渗透压高。一般培养昆虫细胞的培养基的渗透压为340~390mOsmol/kg,而哺乳动物细胞用的培养基的渗透压为290~330mOsmol/kg。

尽管培养基内的无机盐成分类似，不同的昆虫细胞所用的基础培养基内Na+/K+不同。

13章

1、植物细胞培养基由几大类组成？各有何作用？

（1）无机成分：N、P、K、Ca、S等浓度大于0.5mmol／L大量元素及Fe，B，Mn，Cu等浓度小于0.5mmol／L微

量元素。

（2）有机成分 ①含N物质：包括维生素和氨基酸等 ②碳源：2%—5%的葡萄糖或蔗糖

③植物激素：生长素，细胞素和赤霉素等 ④天然复合物：水解蛋白类、酿酒副产品、胚乳液、果汁 （3）抗生素：一般情况下避免添加

（4）凝胶成分：琼脂、琼脂糖、藻酸盐等，起支持作用

2、以MS培养基为例，如何配制植物细胞培养基？应注意什么问题？

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溶化琼脂（600-700ml）

加蔗糖

溶解 液 调pH（5.8） 定容（1L） 分装 包扎及灭菌

母液的量取

混合

3、提高次生代谢产物的途径有哪些？举例说明。

一）筛选得到高产细胞系（株） 二）培养条件 （培养基成分 光 温度 ph 通气量和搅拌转速 前体饲喂 诱导子的应用）三）毛状根培养技术 （四）、冠瘿培养技术 4、提高次生代谢产物的技术有哪些？举例说明。

1 、两步法培养技术 2、 两相培养技术 3、固定化培养技术

5、什么是植物次生代谢产物？一般分为几大类？

次级代谢产物 是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，并非细胞生长所必需的。如生物碱、黄酮、挥发油、皂甙等。

植物次生代谢物一般分为酚性化合物、萜类化合物、含氮有机物三大类。

6、植物细胞生物反应器的选型应考虑哪些方面？

7、名词解释：外植体、愈伤组织、继代培养、次生代谢产物、诱导子、毛状根、冠瘿组织 习惯上把用作细胞培养的材料称为外植体（在原生长部位取得并转移到培养基上生长的组织块

继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。

脱分化后的细胞经过细胞，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之愈伤组织（callus) 次级代谢产物 是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，并非细胞生长所必需的。如生物碱、黄酮、挥发油、皂甙等。 毛状根 是发根农杆菌感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。 冠瘿组织

冠瘿组织 利用根癌农杆菌感染植物可将其Ti质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导植物细胞产生冠瘿组织的发生

第14章 下游加工过程概论

 1、下游加工技术的定义。

发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程称为下游加工过程 

 2、下游加工过程有什么特点和重要性？

特点：发酵产品在培养液中的浓度一般较低，溶液中欲提取物质的浓度越低，提取时所耗费的能量就越大，

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费用也就越高。

◆产品易失活，对热、酸、碱及有机试剂不稳定； ◆对最终产品的质量往往要求极高。

◆发酵液是复杂的多相体系，且粘度大，是非牛顿性流体； ◆发酵液中往往含有性质相近的杂质，分离难度大。

重要性：在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。 对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部分占总投资费用的60％， 对重组DNA生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的80％一90％。

没有经济的下游技术，则不可能实现工业化生产。下游加工的成本是制约生产者提高经济效益的重要因素。下游加工工程研究的目的就是提高产品回收率，降低分离纯化成本。

 3、生物物质分离纯化一般分哪几个阶段？各阶段主要采用的方法有哪些，目的是什么？ 分离纯化的一般流程

（1）发酵液的预处理 方法：离心和过滤 目的：除去不溶性物 （2）产品的提取和浓缩 方法：萃取、吸附、沉淀、蒸发

（3）产品的精制（提纯） 方法：层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳 （4）产品的最后加工 方法：结晶、干燥、蒸馏  4、分离纯化技术路线的选择原则有哪些？ 1、尽可能简单、低耗、高效、快速。

2、分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。 A、分离步骤越多，回收率越低；

B、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长 3、避免相同原理的分离技术多次重复出现.

分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。

4、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。A)引起新的化学污染；B)蛋白质的变性失活 5、合理的分离步骤次序。

原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。

15.发酵液的预处理和固液分离

 1.为什么要进行发酵液预处理？

改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。

 2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂有哪些？

凝聚：在中性盐作用下，由于双电层排斥电位（即ξ电位）的降低，破坏胶体体系的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程称凝聚。只有ξ电位能实际测得，可以认为它是控制胶粒间电排斥作用，用来表征双电层的特征。化合价越高，该ξ值就越小，即凝聚能力越强。絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程。常用絮凝剂：人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亚胺的衍生物、聚合铝盐、聚合铁盐。天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶、糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸。高分子聚合物絮凝剂在胶粒表面上吸附的机理：基于各种物理化学作用，如范德瓦尔斯力、静电引力、氢键和配位键等。究竟以哪一种机理为主，则取决于絮凝剂和胶粒两者的化学结构。 3.发酵液分离的主要方法. 答：过滤操作  4.分离和过滤的主要设备有哪些?

过滤设备按推动力不同可以分为四类：重力过滤、真空过滤、加压过滤和离心过滤。 16章

1、细胞破碎的目的是什么？

答：细胞破碎的目的是使细胞内含物释放出来，转入液相中，以便于进行产物的分离纯化。

2、举出几种细胞破碎常用的方法？

答：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎、酶溶法、化学渗透法。

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3、比较非机械法与机械法的优缺点。 答：非机械法的优点：（1）对产物释出具有一定的选择性。（2）细胞外形保持完整。（3）核酸释出量少，浆液粘度小，便于进一步分离。

缺点：（1）时间长，效率低。（2）化学试剂的毒性。（3）通用性差。 机械法的优点：破碎细胞效率高。 缺点：（1）能耗很高，能量利用率很低，并且产生高温和高的剪切力，易使不稳定产品变性失活。（2）非专一地释放产物，导致液相中成分复杂，给后续的分离提纯带来困难。（3）产生的细胞碎片微粒尺寸分布范围宽，大量细颗粒增加了固液分离的难度。

4、细胞破碎效果以什么来定量表征，如何定义，如何操作。 答：细胞破碎率。

细胞破碎率定义为破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数， S=[(N0-N)/N0] ×100

操作：（1）直接计数法 平板计数

显微镜计数

观察计数（必要时配合染色技术） （2）间接计数法

测定释放的蛋白或酶活力 测定导电率 17章

1、简述蛋白质表面的特性。 答：

2、蛋白质沉淀的主要方法有哪些？

答： 盐析、有机溶剂、重金属盐、有机酸类、超速离心 3、Cohn方程的形式及其中各参数的物理意义。 答：lgS=β－Ks I S:蛋白质的溶解度,g/L I:离子强度 Ks：盐析常数，斜率，与温度和pH无关，与盐和蛋白质的种类有关。 β : 常数,截距,与盐的种类无关,与温度和pH蛋白质种类有关 4、盐析的原理如何，影响因素有哪些.

答：原理：1.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱.

2.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子.

影响因素：溶质的种类、溶质的浓度、PH、温度 5、盐析沉淀与等电法沉淀有什么不同。 答：

6、什么是有机溶剂沉淀法，它的机理如何，有什么特点，影响因素有哪些。 答：

18章 膜分离过程

1 膜分离技术的分类

答：以分离应用领域过程可分为：微滤、超滤、反渗透、纳滤、透析、电透析、渗透汽化 2 各种膜分离技术的原理

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答：（1）微滤和超滤都是利用膜的筛分性质，以压力差为传质推动力，主要用于 截留固体微粒和高分子溶质。 （2）反渗透是在透析膜浓度高的一侧施加大于渗透压的压力，利用膜的筛分性质，使浓度较高的溶液进一步浓缩。

（3）纳滤是介于反渗透和超滤之间的一种压力驱动型膜分离技术。

（4）透析是最早发现、研究和应用的一种膜分离过程，它是利用多孔膜两侧溶液的浓度差使溶质从浓度高的一侧通过膜孔扩散到浓度低的一侧从而得到分离的过程。 （5）电渗析是利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质的分离和溶液的脱盐。 （6）渗透汽化也称渗透蒸发，它是利用膜对液体混合物中组分的溶解和扩散性能的不同来实现其分离的新型膜分离过程 。

3 膜分离常用的材料有哪些？醋酸纤维膜的特点？ 答：（1）膜分离常用的材料有：天然高分子材料 ，如醋酸纤维、纤维和再生纤维；合成高分子材料，如聚砜；无机材料；复合材料

（2）醋酸纤维膜的特点：优点：醋酸纤维的阻盐能力最强，常用于反渗透膜，也可作超滤膜和微滤膜；再生纤维素可用于制造透析膜和微滤膜。

缺点：醋酸纤维膜最高使用温度和pH范围有限，在45-50C，pH3-8。 4 表征膜的性能特征参数有哪些？ 答：（1）孔径、孔径分布和孔隙率 （2）膜的截留能力

5 什么是浓差极化模型？浓差极化是指，当水透过膜并截留盐时，在膜表面会形成一个流速非常低的边界层， 边界层中的盐浓度比进水本体溶液盐浓度高，这种盐浓度在膜面增加的现象叫做浓差极化。 电极上有电流通过时，电极表面附近的反应物或产物浓度变化引起的极化。称为浓差极化 6 常见的膜组件有哪些？

答：膜组件的种类： 管式膜组件、 中空纤维式、平板膜组件、卷式膜组件 7膜分离技术的主要应用在哪些方面？

答：1) 细胞培养基的除菌； 2)发酵液或培养液中细胞的收集和除去； 3)细胞破碎后碎片的除去；4)目标产物部分纯化后的浓缩或滤除小分子溶质；5)最终产品的浓缩和洗滤除盐； 6)蛋白质的回收、浓缩和纯化；7)制备用于调制生物产品和清洗产品容器的无热源水；8)膜生物反应器。 8、请比较说明微滤、超滤、纳滤和反渗透等四种常用膜分离技术的异同点。 答：同：都采用错流过滤方式。

微滤（MF） 对于微滤而言，膜的截留特性是以膜的孔径来表征，通常孔径范围在0.1～1微米，故微滤膜能对大直径的菌体、悬浮固体等进行分离。可作为一般料液的澄清、保安过滤、空气除菌。

超滤（UF） 对于超滤而言，膜的截留特性是以对标准有机物的截留分子量来表征，通常截留分子量范围在1000～300000，故超滤膜能对大分子有机物（如蛋白质、细菌）、胶体、悬浮固体等进行分离，广泛应用于料液的澄清、大分子有机物的分离纯化、除热源。

纳滤（NF） 对于纳滤而言，膜的截留特性是以对标准NaCl、MgSO4、CaCl2溶液的截留率来表征，通常截留率范围在60～90%，相应截留分子量范围在100～1000，故纳滤膜能对小分子有机物等与水、无机盐进行分离，实现脱盐与浓缩的同时进行。

反渗透（RO） 是利用反渗透膜只能透过溶剂（通常是水）而截留离子物质或小分子物质的选择透过性，以膜两侧静压为推动力，而实现的对液体混合物分离的膜过程。

反渗透的截留对象是所有的离子，仅让水透过膜，对NaCl的截留率在98%以上，出水为无离子水。反渗透法能够去除可溶性的金属盐、有机物、细菌、胶体粒子、发热物质，也即能截留所有的离子，在生产纯净水、软化水、无离子水、产品浓缩、废水处理方面反渗透膜已经应用广泛。

19章 溶剂萃取

1、萃取分离的依据是什么？

答：依据：利用溶质组分在两个互不混溶的液相中竞争性溶解和分配性质上的差异进行分离。 2、物质溶解的规律是什么？ 答：（1）碱类物质中可溶的是氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钡和氨水。

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（2）所有盐都是可溶于水的。

（3）氯化物中不溶的有氯化银和氯化亚汞，其它是氯化物都是或溶的。 （4）硫酸盐有不溶于水的有硫酸钡和硫酸铅。

（5）磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐中。只有钾、钠、铵的磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐三种类型的盐可溶于水，其它盐是不溶于水的

（6）银盐只有银可溶。其余的银的氢硫酸盐、或碱都是不溶的。

（7）微溶的有硫酸银、硫酸亚汞、氢氧化钙和氯化铅；亚硫酸镁、硫酸钙、硅酸以及碳酸镁。

3、溶质的分配定律的生物意义和作用？

答：分配定律——是指在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，它在两相的浓度之比为一常数K，这个常数称为分配系数，即： K = C1/C2 = 萃取液浓度/萃余液浓度 作用：分配定律对利用吸收方法来分离气体混合物的工艺有指导作用，也可用来定量计算萃取分离时被提取物的质量或吸收一定量的物质所需的液体量。 4、萃取操作的基本内容和原理？

答：基本内容：将一定量萃取剂加入原料液中，然后加以搅拌使原料液与萃取剂充分混合，溶质通过相界面由原料液向萃取剂中扩散，所以萃取操作与精馏、吸收等过程一样，也属于两相间的传质过程。搅拌停止后，两液相因密度不同而分层：一层以溶剂S为主，并溶有较多的溶质，称为萃取相，以E表示；另一层以原溶剂（稀释剂）B为主，且含有未被萃取完的溶质，称为萃余相，以R表示。若溶剂S和B为部分互溶，则萃取相中还含有少量的B，萃余相中亦含有少量的S。 原理：利用化合物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂中，加入某种可溶性的物质时，它能分别溶解于两种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。 5、多级错流和多级逆流萃取的区别？

答：区别：多级错流萃取每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但由于溶剂分别加入各级萃取器，萃取推动力大，萃取效果较好；多级逆流萃取料液走向和相反，只在最后一级中加入萃取剂，股和错流萃取相比，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。 6、什么是双水相萃取？双水相体系形成的原因是什么？

答：双水相萃取：是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 双水相体系形成的原因：（1）双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，从而分为两相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾向越大。

（2）加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。 9、双水相体系可分为哪几类？影响双水相萃取的因素有哪些？ 答：（1）双水相体系可分为：高聚物/高聚物双水相体系 、高聚物/无机盐双水相体系、 低分子有机物/无机盐双水相体系 、表面活性剂双水相体系

（2）影响双水相萃取的因素：聚合物及其相对的分子量、温度、pH、离子环境

 20 离子交换法

1、什么是离子交换法、交联度、湿真密度、湿堆密 度、交换容量、溶胀性、静态吸附、动态吸附？

 离子交换法：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的离子依靠静电力吸附在吸附剂上然后利用合适的洗脱剂将吸附物从吸附剂上置换下来，进行浓缩富集，达到分离的目的。  交联度：合成树脂时单体中交联剂（如二乙烯苯）的含量百分数称为交联度。

 湿真密度：指湿态离子交换树脂单位真体积的重量；真体积是指离子交换树脂湿颗粒本身固有体积，不

包括颗粒间的空隙体积。

 湿堆密度：指单位堆积体积湿态离子交换树脂的质量。

 交换容量：定义为一定质量或体积的离子交换树脂所带有的交换离子数量。

 溶胀度：◇ 树脂不溶于水，但亲水性强，具有亲水胶体性质，一般吸水膨胀，脱水收缩；  ◇ 测定方法：将10-15ml风干树脂放入量筒，加入欲实验的溶剂（多为水），然后不时摇动，24h后，测

定树脂的体积。前后体积之比称为溶胀度

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 静态吸附：是将交换树脂浸泡于待分离物质的溶液中进行吸附，达到平衡后，进行固液分离，再对树脂

进行洗衣脱。

 动态吸附：是指交换液与树脂层发生相对移动的交换方法。将树脂装入圆筒形的层析柱中，交换、洗脱、

再生等步骤均在柱内进行。

2、离子交换树脂的结构由哪几部分组成？常用的离子交换树脂类型有哪些？

 常用的离子交换树脂：强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸

基）；

 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团；  强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基(N(CH3)3或二甲基-ß-羟基乙基胺基；  弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱 3、离子交换法的基本原理如何？

影响离子交换选择性的因素，影响离子交换速度的因素有哪些？  颗粒大小：愈小越快

 交联度：交联度小，交换速度快

 温度：越高，溶液黏度小、扩散速度越快，离子交换速度也越快  离子化合价：化合价与高，交换越快  离子大小：越小越快

 搅拌速度：在一定程度上，越大越快

 溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快 4、离子交换树脂的选择有何要求？  1、离子交换树脂的选择：

 如强酸性物质应该选用弱碱性阴离子交换树脂，这主要是从是否容易解吸的角度考虑的；因为强碱性阴离子交换树脂固然也能吸附强酸性物质，但洗脱困难； 若产物为弱酸性物质则应选择强碱性阴离子交换

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树脂，如用弱碱性阴离子树脂则不易吸附。 同理，强碱性产物则应选用弱酸性阳离子交换树脂；弱碱性产物则选用强酸性阳离子交换树脂。  2）、其次要考虑交联度

 大分子物质要选择交联度低些的树脂，小分子物质则选用交联度高的树脂； 如强酸性物质应该选用弱碱性阴离子交换树脂，这主要是从是否容易解吸的角度考虑的；因为强碱性阴离子交换树脂固然也能吸附强酸性物质，但洗脱困难； 若产物为弱酸性物质则应选择强碱性阴离子交换树脂，如用弱碱性阴离子树脂则不易吸附。

 同理，强碱性产物则应选用弱酸性阳离子交换树脂；弱碱性产物则选用强酸性阳离子交换树脂。 由于交联度低树脂强度差、易破碎，因此，交联度选择的原则是在不影响交换容量的条件下，尽可能提高交联度。

21 吸附法与色层分离

1.吸附的本质是什么?

溶质从液相或气相转移到固相的现象。 [该过程包括两相:液相(气相)→固相] 2. 吸附的类型有哪些?作用力各是什么? 吸附的类型：

3.常用的吸附剂有哪些?

常用吸附剂：早期使用的吸附剂包括高岭土、氧化铝、酸性白土等无机吸附剂；以及离子交换树脂、活性炭、分子筛和纤维素。

4.吸附剂的主要性能参数及表征方法.  比表面积

 颗粒度和孔结构 大孔 >100 nm；2nm<过渡孔<100nm；微孔<2nm

 表面化学性质 表面含氧官能团的性质；－COOH、－OH等。 有助于对极性分子的吸附；  机械强度高，使用寿命长。 5.影响吸附过程的因素. （1） 吸附剂的性质 （2）吸附物的性质 （3）溶液的pH （4） 温度

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（5）其他组分

6.大网格吸附剂的主要应用. 脱色:食品等.

水中溶解度小的生化产品的吸附:维生素B12;

脂溶性的抗生素:四环素, 土霉素,红霉素,大环内脂类. 污水处理: 色谱柱的载体:

7.固定床和膨胀床的区别?

膨胀（扩散）床吸附的操作和固定床相似，也要经过平衡、进料、淋洗、洗脱等步骤。不同的是进料前必须实现稳定扩张，洗脱后为除去吸附介质上附着的少量残留杂质，还要进行清洗。

色层分离

 什么是色谱分离技术？

色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

 色谱分离技术的分类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理. 按两相状态气相色谱法、气固色谱法 气液色谱法 液相色谱法、 液固色谱法 液液色谱法 按固定相的几何形式柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法

按分离原理吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法。

色谱分离原理：色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。

分离方法：免疫亲和色谱法，属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离。

疏水色谱法，在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。

离子交换色谱法，由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定。由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂。适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）。缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20m mol。色谱方案的确定，需要视试验情况作适当调整。洗脱方式：pH梯度 离子强度梯度

什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？ 塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。 理论板数的计算方法 N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 ttN5.(R)2N16(R)2W1/2Wb 理论塔板高度： L---柱长 LHN

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 什么是吸附色谱及其分类和基本原理？

吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。

（1）物理吸附又称表面吸附，是因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间里的相互作用所引起的。

基本原理：吸附与解吸附的往复循环。 （2）化学吸附

基本原理：产生化学反应。酸性物质与Al2O3发生化学反应；碱性物质与硅胶发生化学反应；Al2O3容易发生结构的异构化，应尽量避免。 （3）半化学吸附

2）基本原理：以氢键的形式产生吸附。

 什么是分配色谱？

分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。

 简述高效液相色谱的工作原理？

高效液相色谱 （HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。

 离子交换色谱的分类及应用 找不到

 凝胶色谱的分离原理及分类

凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。

 离子交换及疏水作用色谱的原理

离子交换层析(IEC)是以离子交换剂为固定相，以含特定离子的溶液为流动相，利用离子交换剂上的可交换离子与溶液中离子发生交换作用，由于不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱,而将混合物中不同离子进行分离的技术。 高效液相色谱的分离原理及应用？跟上题一样的答案

 共价色谱的工作原理？ 找不到

22 电泳分离法

1.名词解释

 聚丙烯酰胺凝胶电泳：是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。  SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS即十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl

Sulfate，简称SDS)是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS一蛋白质复合物。此复合物可用具有SDS的聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)。它的主要用途是分离蛋白质和测定其分子量。

 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳：蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，

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 双向PAGE电泳：由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直于第一向的方向

进行第二向电泳。

4.把浓度为（ ）的凝胶称为标准胶。 A．10% B 7.5% C 6% D 2.4% 5. 判断题：

凝胶浓度越大，孔径越大。（ ）

用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶。（ ）

6．凝胶电泳与凝胶层析中的分子筛效应在分离中的效果是否相同？

 这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流

出。

8.双向电泳的特点：

 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出

它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开

9.PAGE双向电泳中的两向电泳分别是什么电泳技术？ 等电聚焦电泳与SDS-PAGE

23 蛋白质的分离与纯化

1、什么叫包涵体？包涵体形成有哪几种模式？包涵体表达形式在现代生物工艺中的下游处理过程有什么重要意义？

 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内集聚形成的无活性的固体颗粒。包涵体的形成

有两种模式：a是非天然单体蛋白形成的包涵体的模式；b是寡聚蛋白形成的包涵体的模式（较多）。包涵体表达形式赋予了现代生物工艺中的下游处理过程的一项新的内容，在一定程度上改变了传统分离纯化蛋白质的方法，给蛋白质的分离纯化带来了一项新的特点。

2、包涵体对分离纯化有哪些影响？

①可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白质纯化较容易完成；

因为包涵体具有高密度，并且在水溶液中通常不溶解，因此可以通过简单的离心就可以得到，并且可以较容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，有利于表达产物的分离纯化。

②包涵体可以从匀浆液中以低速离心出来，以促溶剂（尿素、盐酸胍、SDS）溶解，在

适当条件下（pH、离子强度与稀释）复性，产物经过一个变性复性过程，较易形成错误折叠和聚合体。

③包涵体的形成虽然增加了提取的步骤，但包涵体中目的蛋白质的纯度较高，可达到

20~80%，且重组蛋白以包涵体的形式表达能有效地抵御如大肠杆菌中蛋白酶对表达蛋白的降解。；

④对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白，包涵体的形成无疑是最佳选 择。

3、包涵体的分离纯化工艺包括哪些过程？

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4、什么是重组蛋白的体外折叠？折叠过程包括哪几个步骤？重新折叠的方法有哪些？  重组蛋白的体外折叠是指采用适当的条件使伸展的变性重组蛋白质重新折叠成可溶 性的具有生物活性的蛋白质。

折叠过程可能包括：①分子内部疏水区域的聚集；②形成部分的二级结构作为后序折叠的骨架；③形成共价键（如二硫键）以稳定蛋白质构象。这三个步骤可穿插完成。

重新折叠的方法：（1）稀释与透析方法 （2）色谱方法

24、结晶与干燥

1、什么是结晶，溶液结晶方法大致分为几类？

物质从液态（液体或熔融体）或气态形成晶体的过程叫结晶。 溶液结晶方法大致分为三类：凝华结晶、溶液结晶（本章专指）、熔融结晶 2、结晶与沉析有何异同？ 结晶与沉析的异同： 原理 过程 析出物 操作方法 用途 结晶 利用溶质之间溶解性的差别进行分离纯化 固体从溶液中析出 结晶 通过蒸发溶剂或冷却降低溶解度 主要用于产品的进一步纯化 沉析 相同 相同 非结晶 通过加入物质改变溶解度 较多用于产品的初步分离 3、根据溶解度随温度的变化特征，可将物质分为几种类型？

 溶解度随温度的升高而迅速增大。（大部分）  溶解度随温度的升高以中等速度增加。  溶解度随温度的升高只有微小增加。  溶解度随温度的升高反而下降。

4、溶质从溶液中析出一般分为几个阶段？晶核生成机制和晶体生长机制如何？

 溶质从溶液中析出一般可分为三个阶段：过饱和溶液的形成、晶核的生成和晶体的 成长阶段。

1）成核的机制有3种：

（1）初级均相成核：指溶液在较高过饱和度下自发生成晶核的过程。

（2）初级非均相成核：指溶液在外来物的诱导下生成晶核的过程，可在较低的过饱和 度下发生。

（3）二次成核：含有晶体的溶液在晶体相互碰撞或晶体与搅拌器或器壁碰撞时所产生 的微小晶体的诱导下发生的（生产较多采用）。

2）晶体生长机制

在过饱和溶液中已有晶体形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，溶质质点会继续 一层层地在晶体表面有序排列，晶体将长大，这个过程称为晶体生长。

机制：二维生长学说。

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认为晶体是由许多小立方体堆砌而成的，各小立方体可以认为是微小的粒子，也可 以是原子、分子、离子或分子团。

5、什么是冷冻干燥？其原理如何？

概念：冷冻干燥是真空冷冻干燥的简称，也简称冻干。是指物质经低温完全冻结成固 态，并在减压条件下使大量溶剂（一般是水）升华成蒸气，从而达到低温除去溶剂的过程。

基本原理：是使冰冻物质中的水分或其他蒸气压较高的物质，在低温真空系统中进行 升华而使样品本身干燥。

要完成这一过程，必须有：低温和真空设备，需加热，合理的操作方法。 6、如何进行冷冻干燥除水？

（1）低温冷凝除水（适用于实验实和大量生产） 在冷凝器中结冰，可以除去大量水分。 （2）干燥剂除水（适用于100mL或以下较小量的干燥）

常用干燥剂有硫酸钙、氯化钙、Mg(ClO3)2、硅胶、五氧化二磷（最强、较贵且不能重 复使用）和氢氧化钠（最弱）等。

（3）抽气机直接除水

水蒸气喷射抽气机或油泵可以一同使用。需要较大的抽气泵，不太适合实验室研究之用。 7、制品的冷冻干燥过程主要包括几个阶段？如何操作？ （1）制品预处理

按一般经验通常要求制品的固体含量为4~10%较为适宜。为使制品有一定的固体量并保持制品的活性和溶解度可加入保护剂。 （2）制品的预冷

预冷的目的是将溶液中的自由水固化，使干燥后产品与干燥前有相同的形态，防止抽真空干燥时起泡、浓缩和溶质移动等不可逆变化发生，减少因温度下降引起的物质可溶性降低和生命特性变化。 3）升华干燥过程

升华过程是冷冻干燥的核心。干燥箱预冷（-20℃）→干燥箱及冷凝器抽真空（13Pa以下）→搁板加温，此时制品开始升华。 （4）解吸干燥过程

制品升华结束时约残留有5~10%的水分，需要进一步干燥，此时干燥通常称为解吸干燥。干燥物物质的含水量是衡量干燥物质质量的重要标志。一般生物制品含水量通常要求在2%，特殊的物质如蛋白质应小于1%。 （5）密封保存

冻干后的制品必须进行封口，以防水分侵入和污染。密封的样品宜在低温干燥的环境下储存。 8、什么是喷雾干燥，原理如何？喷雾干燥过程可分为哪几个阶段？

喷雾干燥是用雾化器将原料液分散成细小雾滴，并用热空气（或其他气体）与雾滴直接接触的方式进行干燥而获得粉状产品的一种干部燥过程。

原理：喷雾干燥是利用不同的喷雾器，将悬浮液和粘滞的液体喷成雾状，形成具有较大表面积的分散微粒同热空气发生强烈的热质交换，迅速排除本身的水分，在几秒至几十秒内获得干燥。

喷雾干燥过程可分为三个基本阶段：料液雾化为雾滴；雾滴与干燥介质接触、混合及流 动，即干燥；干燥产品与干燥介质分离。

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