猪体细胞克隆技术的研究进展 任建诚闻福安罗光彬（沈阳农业大学动物胚胎实验室１１０１６１） 核移植（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ＮＴ）是将动物早期胚胎或体细胞的核 移植到去核的受精卵或成熟卵母细胞 的细胞质巾．从而获得重构胚．并使 其恢复细胞．继续发育为与供体 细胞基因型完全相同的后代的技术。 它在动物育种、制备转基因动物、基 因治疗和器官移植等方面具有重大的 作用。核移植凼供体核的来源不同可 分为胚细胞核移植与体细胞核移植。 体细胞核移植法生产的克隆猪诞生至 今已９年．虽然同胚胎细胞核移植相 比，体细胞核移植技术难度大．成功 率低（１～２％），近年来有ｒ较深入的研 究。在畜牧生产中，利用猪体细胞核 移植技术可培育优良的猪种，加速猪 遗传改良进程：在医学上．利用克隆 转基因技术生产经遗传修饰的克隆猪， 可以提供大量廉价的器官以进行异体 器官移植的临床研究和应用。 １国内外研究现状 以核移植为技术核心的动物克隆 研究已历经半个多世纪，１９９７年第一 只体细胞克隆绵羊——多莉（Ｄｏｉｌｙ） 的诞生揭开了体细胞核移植的序幕［ＩＪ。 世界上先后 生了多种体细胞核移植 动物，供核细胞的种类也在不断拓宽。 体细胞核移植转基因猪的研究进展飞 速。尽管体细胞核移植技术已在牛、 羊、小鼠、猪等动物上获得成功，但 总效率仍较低。而猪的体细胞核移植 效率更低，体外成熟卵母细胞组成的 重构胚发育至囊胚的比例在７～１０％、 体内的为１０～３１％，｛｝｛生活仔数与移植 胚的比率仅为１％左右 。相对而言， 猪的体细胞克隆研究进展较慢．其主 要原因是猪的生殖细胞、胚胎体外显 微操作难度较大：妊娠维持有别于其 它家畜，需具备～定量的胚胎数， ２０００年才有所突破，获得体细胞克隆 后代［４，５１。 西北农业大学窦忠英等（１９９５） 用胚胎细胞核移植获得了６头猪。 １９９６年，湖北农科院魏庆信等得到了 胚胎细胞核移植猪。东北农业大学的 李光鹏等（１９９８）把猪４细胞胚胎的 细胞核通过电融合移植到去核的体内 和体外成熟卯母细胞中，ｍ生了２头 克隆猪。孙兴参等获得了猪卵丘细胞 克隆囊胚ｌ ６ｌ。２００３年，西北农林科技 大学冯秀亮得到了人体细胞和猪卵母 细胞异种核移植囊胚 】。中国农业大 学潘登科（２００５）得到低氧培养早期 胚胎克隆小型猪 。刘忠华等（２００６） 获得了第一例成体体细胞克隆猪１９］。 学者Ｗｕ等获得转ｐＬＦ（乳铁传递 蛋白）和ｈＦＩＸ（人凝血因子Ｉｘ）基因 克隆猪［１吲。韩国于２００２年成立了转基 因克隆猪研究中心，获得转ＧＥＦＰ基因 克隆猪．并在２００５年８月１８ Ｆｊ首次 获得转ＧＭ—ＣＳＦ（粒细胞一巨噬细胞集 落刺激因子）基因克隆猪。 ２核移植技术 在大型哺乳动物中，猪的核移植 难度最大。２０００年，Ｐｏｌ￣ａｅｖａ等ｆｌｌ 用猪胎儿成纤维细胞作为供体细胞获 得世界首例体细胞核移植猪。总体来 看猪体细胞克隆的关键技术主要包括： （１）供体细胞的选择和处理； （２）受 体细胞即卵母细胞的去核处理； （３） 重构胚的融合； （４）重构胚的激活 等。猪体细胞核移植技术涉及卵母细 胞的体外成熟培养，供体细胞的分离 和处理，重构胚的人Ｔ融合和激活， 重构胚胎的培养和移植．受孕的激发 和维持。近几年来在这方面都进行了 大量深入的研究，多个研究小组都得 到了体细胞克隆猪，但是猪体细胞核 移植的效率非常低．仅占移植重构胚 比例的１～２％ ２．１供体细胞的选择和处理 ２．１．１供体细胞类型对猪体细胞核 移植的影响 对猪而言，体细胞核移植成功较 晚，仅以猪的胎儿成纤维细胞和颗粒 细胞作为供体细胞，成功地得到了核 移植后代＿ｌ２＋ 。现在普遍选择去核的 卵母细胞作为胞质受体。Ｌｅｅ等为了研 究更适合于猪核移植的供体细胞．比 较了猪胎儿成纤维细胞、成体的成纤 维细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞 作为核移植供体细胞构建的重组胚胎 发育到囊胚的能力㈣。张德福等通过 比较成纤维细胞、卵丘细胞（Ｃｕｍｕｌｕｓ Ｃｅｌｌｓ，ＣＣ）、颗粒细胞（Ｇｒａｎｕｌｏｓａ Ｃｅｌｌｓ，ＧＣ）、输卵管上皮细胞等体细胞 ２０１０．４口匣蜀匦蜀囤１ ４５ （Ｏｖｉｄｕｃｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，ＯＥＣ）和耳 起［１７－１９］．去核时用去核针去除第一极 体及突起的胞质以去除卵母细胞细胞 乙二醇（ＰＥＧ）也可用于细胞融合，但 因其诱导融合效率低．对胚胎毒性较 大，故未得到广泛应用。后来， 皮成纤维细胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌｓ，ＦＣ）， 表明成纤维细胞、卵丘细胞是较合适 核，此外也可使母源染色体同第二极 体一起排 而达到去核目的【删。（２） 半卵法： “半卵法”是将卵母细胞切 为两半，去掉含有极体的一半，然后 用不含极体的一半进行核移植。虽然 这种方法的去核率可保证１００％，但由 的供体细胞，取材方便，形成重构胚 后囊胚发育率较高［ｉＳ。Ｈｙｕｎ等研究发 现从经产母猪获得卵母细胞，无论在 成熟率还是在体外发育能力都比从未 产母猪获得的卵母细胞好㈣。由此可 Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ用电融合法诱导绵羊供核细 胞与去核卵母细胞融合．融合效果明 显好于病毒介导的细胞融合．此后这 一方法在核移植试验中得到广泛应用。 目前大多数核移植试验均采用电融合 见，选择经产母猪体内成熟的卵母细 胞作为胞质受体将提高克隆的效率。 ２．１．２体细胞周期同步化对猪体细 胞核移植的影响 供体细胞的细胞周期也是影响核 移植的一个重要因素．供体细胞的细 胞周期必须和受体细胞的细胞周期一 致，这样才有利于重组胚胎的发育。 避免染色体的损伤。目前体细胞核移 植中常用的方法就是将处理后的供体 细胞核移人去核的ＭⅡ期卵母细胞中。 迄今为止，几例成功的猪体细胞核移 植研究中，都采用去核的成熟卵母细 胞（ＭＩＩ期）作为核受体。大多数研究 者认为，用成熟的去核卵母细胞（ＭⅡ 期）作为核受体才有利于已分化的供 体核在重构胚中的再程序化，从而保 证了一定的核移植成功率Ｊｉｌｌ。 Ｊｊ用去 核的ＭＩＩ期卵母细胞作为受体细胞时． 供体细胞的细胞周期选择尤为重要．必 须使供体细胞与受体细胞的细胞周期同 步化，这样有助于重组胚胎的发育。 ２．２受体细胞的去核处理 卵母细胞的去核是影响核移植效 率关键因素之一。卵母细胞的去核方 法主要有以下几种： （１）肓吸法和化 学法。盲吸法是利用第一极体刚排出 或排ｍ后不久，染色体就在极体的附 近的原理，用显微去核针吸取极体附 近的部分细胞质以去除细胞核：化学 去核法一般是利用化学试剂处理卵母 细胞，通过使核区变透明或使核区位 置在卵母细胞细胞膜表面形成突 １ ４６口叵目匿口 ２０１０．４ 于细胞质减半．会影响胚胎的正常发 育。因此，有人通过将两枚去核的半 卵与供体细胞融合，并取得了良好的 效果。Ｖａｊｔａ等利用此法获得了克隆牛． 由于此法不需显微操作仪，在体视显 微镜下即可完成，因此在实际生产中 具有重大意义【２１】。（３）荧光引导去核法： 荧光引导去核法是用Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２荧 光染料对卵母细胞染色后在荧光显微 镜下确定核的位置，去核后再观察吸 去的细胞质或去核后的卵母细胞是否 含有细胞核，以保证去核成功。该法 的去核准确可靠，最高可达９９．３％｛２２１。 （４）微分干涉与极性显微镜去核法： 微分干涉和极性显微镜去核法最初用 于一些脂肪颗粒含量较少的卵母细胞． 如兔和小鼠等卵母细胞在微分干涉相 差显微镜下可观察到染色体。因此， 对于这类卵母细胞可直接在微分干涉 相差显微镜下去核㈣。然而，对于脂 肪颗粒含量较多的卵母细胞（如牛和 猪），在微分干涉相差显微镜下则观察 不到染色体 ２－３融合方法对猪重构胚的影响 供体细胞可注入至去核卵母细胞 的卵周隙也可直接注入至去核卵母细 胞的卵胞质内。注入至卵周隙的供体 细胞需与受核胞质融合后方可形成新 的胚胎，即通过细胞膜的融合将两个 细胞融合成一个细胞。细胞融合法包 括仙台病毒、化学和电融合 种方法。 最早的克隆采用病毒介导融合法，但 仙台病毒对胚胎发育有不良影响：聚 方法进行克隆胚胎的构建。电融合所 使用的电场强度、脉冲次数等，对核 移植胚的融合率及体外培养发育率影 响很大。经对小鼠、山羊、猪、兔和 牛的核移植研究发现．电融合条件对 核移植胚的融合和体外发育均有明显 影响【 。而体细胞直接注入到去核 卵母细胞胞质中不需融合即可获得重 构胚胎。Ｗａｋａｙａｍａ等利用直接注入法 获得了卵丘细胞核移植小鼠［删。 ２．４激活方法对猪重构胚的影响 以成熟卵母细胞为受体的核移植 中，由于缺乏诸如受精等自然的过程， 故必须对卵母细胞进行人Ｔ激活以促 使其进一步发育。目前应用于猪体细 胞克隆激活方法可以分为 大类：物 理激活、化学激活和联合激活。目前 猪重建卵子的激活多采用联合激活的 方法．因为该种激活方法和单纯的化 学激活或者物理激活相比，对重构胚 的激活效率更高，能够充分地激活重 构胚。卵母细胞激活的原理为通过电 刺激、钙离子载体等方法，使卵母细 胞从ＭⅡ期中释放 来，并恢复到受 精时的状态。由精子诱发的正常卵母 细胞激活，可引起卵母细胞质钙离子 浓度脉冲性规律升高，并一直持续几 个小时。电刺激等引起的卵母细胞质 的激活可能不在于电刺激本身，而在 于电刺激等引起的膜穿孔进一步引起 了离子流动。卵母细胞的充分激活是 一种持续机制而并非点状事件．而最 有效的激活程序毫无疑问应是模仿精 子对卵母细胞刺激的反应。电脉冲可 使胞质膜上形成小孔，膜去极化、渗 透性改变，使细胞内游离钙离子瞬间 释放；电脉冲另一个可能途径是质膜破 裂．启动磷酸戊糖途径，某些膜表面 受体激活后．促进肌醇磷酸脂水解成 磷酸肌醇．刺激细胞内钙离子的释 放，细胞内钙离子释放后作为第二信 使促使细胞外钙离子内流：第３种可 能途径是电刺激引起膜电压依赖性钙 通道开放。还有一些研究表明．注射 精源性因子可能会模拟自然过程的钙 离子波动，然而此方法的效率较低［２７１。 ３应用前景 总的来说．在过去的十多年里能 被克隆的动物越来越多，但目前核移 植就其技术本身并没有多大改善，胚 胎发育机制及等基础性问题知之 甚少，成功率低只能达到１－２％．这一 技术结果的不确定性所引起的负面效 应要引起足够的重视。但核移植技术 的迅速发展已为我们展示出美好的前 景，如拯救珍稀濒危动物、动物性别 的控制、进行异体器官移植、应用于 克隆性治疗及生产药用蛋白等。由于 克隆猪的成功，异体移植可望得到解 决。因为猪的器官在大小、形状及生 理特点等方面与人的器官非常相似。 相信随着研究的不断深人．体细胞核 移植效率一定会得到大幅度提高．并 最终可服务于生产。 参考文献 ［１】Ｗｉｌｍｕｔ Ｉ，Ｓｃｈｎｉｅｋｅ Ａ Ｅ，Ｍｃｗｈｉｒ Ｊ，ｅｔ １ａ．Ｖｉａｂｌｅ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅＵｓ Ｕ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，２（３８５）： ３１（卜３１８ 『２ｊ Ｗｉｌｍｕｔ Ｉ，Ｂｅａｕｊｅａｎ Ｎ，ｄｅ Ｓｏｕｓａ ＰＡ， Ｄｉｎｎｙｅｓ Ａ，Ｋｉｎｇ ＴＪ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＬＡ，ＷｅＢｓ ＤＮ， Ｙｏｕｎｇ ＬＥ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［『】． Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１９：５８３－５８５ ［３】ｌｍ ＧＳ，Ｌａｉ Ｌ，Ｌｉｕ Ｚ，Ｈａｏ Ｙ，Ｗａｘ Ｄ， Ｂｏｎｋ Ａ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍ－ ｂｒｙｏｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｇａｓ ａｔｎｌｏ－ ｓｐｈｅｒｅｓ 田Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００４，６１（６）： １１２５－１ｌ３５ ［４１ Ｐｏｌｅｊａｅｖａ ＩＡ，Ｃｈｅｎ ＳＨ，Ｖａｕｇｈｔ ＴＤ， ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｆｏｍ ａｄｕｌｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅＨｓⅡ】．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７ （６８００）：８６－９０ （５】Ｑｎｉｓｈｉ Ａ，１ｗａｍｏｔｏ Ｍ，ＡｋｉｔａＴ，ｅｔ ａ１． Ｐｉｇ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌｓａｔ ｎｕｃｌｅｉ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００．２８９：１１８８￣１１９０ ［６】孙兴参，岳奎忠，邹贤刚，等．颗粒细 胞核移植猪的初步研究［Ｊ］．东北农业大报， １９９９，３０（３）：１０￣４１１ 冯秀亮．人一猪异种细胞核移植研究 ［Ｄ］．西北农林科技大学博士论文，２００３ ｆ８】潘登科，张运海，孙秀柱，等．低氧培 养早期胚胎克隆小型猪（Ｓｕｓ Ｓｃｒｏｆａ）ＬＪ］．科学 通报，２００６，５１（４）：４１６～４１９ ［９】刘忠华，田江天，郑重，等．体细胞核 移植克隆：培养液对卵母细胞成熟及胚 胎发育的影响［Ｊ］．２００７，３７（６）：卜７ 【１０】Ｗｕ ＳＣ，Ｌｅｅ Ｊｗ，Ｔｉａｎ ＸＣ，ｅｔ ａ１． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ——ｃｅｌｌ ｉｎ—— ｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ田．Ｂｉｏｌ Ｋｅｐｒｏｄ， ２００３，６９（３）：９９５－１００１ ［１１】Ｐｏｌｅｊａｅｖａ ＩＡ，Ｃｈｅｎ ＳＨ，Ｖａｎｇｈｔ ＴＤ， ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｆｏｍ ａｄｕｌｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓⅡ】．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７ （６８００）：８６￣９０ ［１２１ Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｋ，Ｒｚｕｃｉｄｌｏ Ｓ Ｊ，Ｇｉｂｂｏｎｓ Ｊ Ｒ．ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｍｅｔａｐｈａｓｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｏｏｃｙｔｅｓ ｍａｔｕｒｅｄ ｉｎ ａ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ田．ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２００１（１） ：１２ ［１３１ Ｓｍｉｔｈ Ｌ Ｇ，Ｗｉｌｍｕｔ Ｉ，Ｗｅｓｔ Ｊ Ｄ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｆｒｓｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｎ－ ｓｔｉｔｕｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓⅡＪ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｆｉｌ， １９９０，８８（２）：６５５￣６６３ ［１４】Ｌｅｅ Ｊｗ，ＴｉａｎＸＣ，Ｙａｎｇ）（．Ｏｐｔｉ— ｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅⅡ１ Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，２００４，６８（１）： ５１￣５７ ［１５】张德福，王英，陈凯，等．猪体细胞 核移植重构胚的体外发育及其影响因素硼． 实验生物学报，２００３，１：５９￣６３ ［１６】Ｈｙｕｎ Ｓ Ｈ，Ｌｅｅ Ｇ Ｓ，Ｋｉｍ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ｄｅ— ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＳＯＷＳ ｏｒ ｇｉｌｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］ Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００３ ，５９：１６４１—１６４９ ［１７】王敏康，刘冀珑，李光鹏，等．生殖医 学杂，￣－Ｉｌ１．２００１，１０（４）：２２７￣２３２ ［１８】Ｙｉｎ Ｘ Ｊ，Ｔａｎｉ Ｔ，Ｙｏｎｅｍｕｒａ Ｉ，ｅｔ ａ１． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ［『】．２００２，６７（２）：４４２－４４６ ［１９】Ｋａｗａｋａｍｉ Ｍ，Ｔａ Ｔ，Ｙａｂｕｕｃｈｉ Ａ， ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕ】．２００３，５（４）：３７９～ ３８７ 【２０】Ｂａｇｕｉｓｉ Ａ，Ｏｖｅｒｓｔｒｏｍ Ｅ Ｗ．Ｔｈｅｆｔ— ｏｇｅｎｏｌｏｇｙ Ｕ】．２０００，５３：２０９ ［２１ｊ Ｖａｊｔａ Ｇ，Ｂａｒｒｅｌ Ｐ，Ｊｏｕｂｅｒｔ Ｊ，ｅｔ ａ１． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．２００４，６２（８）：１４６５～１４７２ 【２２】Ｑ．Ｚｈｏｕ，Ｌａｕｒｅｎｔ Ｂ，Ｊｅａｎ Ｐ Ｒ． Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｕ】．２０００，２：３５ ［２３】Ｋｏｎｏ Ｔ，Ｋｗｏｎ Ｏ Ｙ，Ｎａｋａｈａｒａ Ｔ． Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ［Ｊ１．１９９１，９３：１６５～１７２ 【２４】Ｋｅｅｆｅｒ Ｃ Ｌ，Ｋｅｙｓｔｏｎ Ｒ，Ｌａｚａｒｉｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕ１ｌ２００２，６６：１９９～ ２０３ ［２５】 ｋｙｏ Ｎ，Ｗｏｌｆｅ Ａ Ｐ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ Ｕ】． ２０００，１１３：１１－２０ ［２６】Ｗａｋａｙａｍａ Ｔ，Ｐｅｒｒｙ Ａ Ｃ，Ｚｕｃｃｏｔｔｉ Ｍ，ｅ ｔａ１．Ｎａｔｕｒｅ［Ｊ］．１９９８，３９４：３６９￣３７４ ［２７］韩建永，桑润滋哺乳动物核移植技 术研究进展Ⅱ】．河北农业大学学报．２００１，２４ （３）：１０５～１０９，１１２ ２０１０．４口叵目面田 １ ４７
