免疫荧光检测

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）

荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。

抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。 抗核抗体实验原理

以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。

试剂与器材

1．抗原片 现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下：

(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

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(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。

(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。

2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。

3．0.01mol/L pH7.2 PBS

4．缓冲甘油 取甘油9份加PBS 1份。

5.待测血清、阳性和阴性对照血清 临床标本筛选获得。

6．器材 荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等

操作方法

1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。

2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。

3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。

4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟 。

5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液

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的小杯中至少1分钟。不必混摇。

6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

7．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

8．封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：每反应区约10μl。从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下1张。

结果判定

荧光显微镜下观察

1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：

①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；

②周边型(核膜型)：细胞核周围呈现荧光；③斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；

④核仁型：核仁部分呈现荧光。

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⑤混合型：两种以上核染色；

⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA)

注意事项

1．PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。

2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。

3．血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。

4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。

5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。

6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。

7．封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。封好的载片可于4℃长期保存。

实验讨论

方法评价 间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。

鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。Hep-2细胞具有核大、有丝旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。

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检测抗核抗体(ANA）的实验方案

ANA简介

抗核抗体（antinuclear antibodies，ANAs）

经典定义：针对细胞核成分的一大组抗体谱。

抗核抗体新概念（FANA）

传统定义：顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称 ® 狭义定义

现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸(nucleic acid)和核蛋白（nucleoprotein)抗体的总称 ® 广义定义

靶抗原分布： 细胞核

细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞周期

抗核抗体检测方法

检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIF

ANA检测方法进展：仅限于IIF改良法（底物选择、制备方法）试图将ELISA发推广为最基本的筛选方法未获成功

复制细胞抗原全部成分极其困难 ® 抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构

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荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性

IIF 法：HEp-2细胞底物（90%以上实验室采用）

# 完整的ANAs抗原谱（细胞核、 浆、骨架、周期）

# 可预测分析ANA靶抗原范围

# 经验性强

ELISA法：采用高度纯化抗原或全细胞抗原

# 抗原谱有限（十余种）

# 假阴性结果

# 操作简单快速

其他方法：金标法、比浊法

ANA靶抗原

多核苷酸：双链DNA、单链DNA、RNA

组蛋白：H1，H2A，H2B，H3，H4，H2A-H2B复合物

核浆的核糖核蛋白:U1-nRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、.

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、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗

Mi-1.

原…

核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl(PM-1)、7-2-RNP(To)、4-6-S-RNA、核仁形成中心（NOR）…

核膜抗原：板层素（层粘连蛋白）

着丝点：着丝点蛋白

……

ANA检出率

与年龄和性别有关

与个体的免疫稳定性相关

使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA。

_________天然ANA_________

生理性自身免疫

维持机体内环境的生理稳定。

滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。

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ANA检测方法

初筛抗核抗体：IIF

最佳基质 ：联合生物薄片(HEp-2 细胞/猴肝冰冻组织)

区分抗核抗体的靶抗原：ELISA、印迹法和免疫印迹法

ANA初筛

IFT：HEp-2细胞/灵长类肝脏

完整的抗原谱（细胞核及细胞浆）

可预测靶抗原

协助检测其它项目（如 ANCA、ENA）

ELISA：采用高度纯化的抗原初筛ANA

抗原谱有限

操作简单快速

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采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验

为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术? :滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。并

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且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。

准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或Extran MA 01（默克公司），再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的Sekusept Extra （汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。

稀释： 按照试剂盒使用说明稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。

加样：在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加样板。

加样体积:

10 µl/反应区(3 x 3 mm)

25 µl/反应区(5 x 5 mm)

70 µl/反应区(7 x 9 mm)

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温育：将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温温育30分钟。

清洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

冲洗1秒钟

小杯内浸洗5分钟

加样：将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。

加样体积:

10 µl/反应区(3 x 3 mm)

20 µl/反应区(5 x 5 mm)

60 µl/反应区(7 x 9 mm)

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温育：从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。

清洗： 用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl)伊文氏蓝进行复染。

冲洗1秒钟

小杯内浸洗5分钟

封片： 在盖玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。

封片体积:

10 µl/反应区(3 x 3 mm)

10 µl/反应区(5 x 5 mm)

20 µl/反应区(7 x 9 mm)

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结果判断：荧光显微镜下观察荧光。

具体操作

荧光工作台的布置

清洗

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载片的擦拭

封片

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ANA的结果

间接免疫荧光法的独特优势 (一种基质 – 可筛查上百种不同的抗体 )

用HEp-2细胞检测自身抗体

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ANA荧光模型

核均质型

核仁型

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核颗粒型

胞浆型

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ANA确认实验（1）

IFT:

-HEp-2细胞/灵长类肝脏：特殊的荧光模型

如着丝点、 核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白

ELISA:

-ANA分项(含ENA 谱):包被高度纯化抗原

斑点法 / 印迹法

-ENA 谱:采用各种高度纯化的抗原

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ELISA：抗ENA 谱

印迹法：抗ENA 谱

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印迹法：抗ENA谱

免疫印迹法

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ANA确认实验（2）

Westernblot:HEp-2 细胞提取物

- 定性

- 适宜特别需要 （如区分靶抗原Ro 52 或Ro 60）

- 检测目前无法纯化的靶抗原的抗体 （如PM-Scl、Ku）

结 论

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初筛实验：

免疫荧光技术(HEp-2细胞/灵长类肝脏）

ELISA （纯化的多种核抗原）

确认实验：

ELISA

印迹法

斑点法

Westernblot

ANA谱与相关疾病

相关疾病的ANA谱

ANA的各种荧光模型、 靶抗原及相关性

高滴度的ANA仅出现在自身免疫性疾病中

自身免疫性疾病 ANA阳性率（％）

系统性红斑狼疮

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活动期 95－100

非活动期 80－100

药物诱导的红斑狼疮 100

混合性结缔组织病 类风湿性关节炎 进行性系统性硬化症 多发性肌炎及皮肌炎 85干燥综合征 30慢性活动性肝炎 70溃疡性结肠炎 70其它风湿病 SLE抗核抗体的检出率

靶抗原 dsDNA .

100

20－40

20－50

－95

－50

－80

－80

26

检出率（%）

30-90

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Sm 5-30

核糖体P蛋白 5-15

周期蛋白I （PCNA） 3

ssDNA 70-95

组蛋白 40-80

U1-nRNP 15-40

SS-A 20-60

SS-B 10-20

Ku 5-10

心磷脂、 b2-GP1 20-40

抗细胞抗体荧光模型(immunofluorescent pattern)

常见的荧光染色模型有6种：

核均质型（homogeneous pattern，H）

核颗粒型（Granulogus pattern，S）

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核仁型（nucleous pattern，N）

核膜型（membranous pattern，M）

着丝点型（centromert pattern，ACA）

胞浆型（cytoplasmic pattern，ACYA）

HEp-2细胞/灵长类肝脏：核均质型

ssDNA / dsDNA

靶抗原：单链、非天然DNA（嘌呤和嘧啶硷基对）

双链、天然DNA （脱氧核糖核酸结构）

相关性： ssDNA

类风湿 80.8%

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SLE 40.0%

干燥综合征 44.0%

皮肌炎 12.3%

类风湿性关节炎 51.7%

献血员 6.8%

SLE 30% - 90%

抗dsDNA：绿蝇短膜虫

组蛋白

靶抗原：组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4

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（主要抗原H1和H2B）

功能： 形成核小体

相关性：药物诱导性LE:100%（唯一的标志抗体）

SLE： 40% - 80%

其它风湿性疾病： 少见

HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗RNP/Sm

U1-nRNP

靶抗原：与U1-nRNA 连接的3个蛋白分子（70K、A和C蛋白）

功能：切割pre-mRNA

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相关性：MCTD: 95% - 100%

SLE: 15% - 40%

抗Sm抗体

靶抗原：与U1-、U2-、U4-、U5- 或U6-nRNA 连接的6 种不同蛋白分子

（core proteins B, B´, D, E, F, G）

功能：切割pre-mRNA

相关性：SLE: 5% - 30%

HEp-2细胞/灵长类肝脏: 抗核糖体P蛋白

抗核糖体P蛋白抗体

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抗原：核糖体的亚单位( 60S), 3个蛋白分子组成: P0、P1、P2 （38、19、17 kDa）。

在碳末端具有相似的免疫反应表位。

功能：蛋白合成易位过程中的辅蛋白

相关性：SLE：5% - 15%

原发性干燥综合征的抗体谱

靶抗原 阳性率 （%）

SS-A 40-95

SS-B 40-95

ssDNA 40-95

HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：抗SS-A/SS-B

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抗SS-A抗体

靶抗原：与 Y1, Y3, Y4 或Y5 型 RNA 连接的2个蛋白（52 kDa和60 kDa）

功能： 调节 mRNA 的转译活性

相关性：干燥综合征：40% - 95%

SLE: 20% - 60%

抗SS-B抗体

靶抗原：与 小分子RNA （U6-RNA, pre-tRNA） 结合的磷脂蛋白 （48 kDa）

功能： RNA多聚酶III的辅蛋白

相关性：干燥综合征： 40% - 95%

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SLE: 10% - 20%

进行性系统性硬化征的抗体谱

靶抗原 阳性率 （%）

着丝点 80-95

Scl-70 25-75

ssDNA 30-60

原纤维蛋白 5-10

RNA 聚合酶 4

PM-Scl （重叠综合征） 3

NOR-90 （核仁形成区） 少见

Ku （多肌炎型重叠综合征） 1-7

HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗着丝点抗体

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抗着丝点抗体

靶抗原： 连接动粒（着丝点） 上的4个蛋白分子：A- 、B- 、C-、50 kDa)

主要的靶抗原：着丝点B蛋白（与 IIFT相关性： 100%）功能：与纺锤体纤维连接

相关性：硬皮病：18%

局限性硬化征 (CREST 综合征):80%-95%

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗Scl-70

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蛋白，分子量（17 、80、140、D-

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抗Scl-70抗体

靶抗原：DNA拓扑异构酶I （100 kDa）

功能：DNA复制和翻译过程的辅蛋白

相关性：硬皮病：25% - 75%

HEp-2/灵长类肝脏：抗PM-Scl

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抗PM-Scl抗体

靶抗原：多个蛋白分子的复合物

主要的靶抗原100 kDa

（与 DNA拓扑异构酶I不同）

功能：未知

相关性：硬皮病： 2% - 5%

肌炎： 8%

重叠综合征： 24%

HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：抗RNA多聚酶

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RNA多聚酶I、II和III

靶抗原：多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物

功能： 多聚酶 I: 转录rRNA基因

多聚酶 II: 转录 mRNA 基因

多聚酶 III: 转录 tRNA 基因

相关性：硬皮病： 4%

HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：抗原纤维蛋白

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抗原纤维蛋白 （U3-nRNP）抗体

靶抗原：与基础蛋白 （34 kDa） 连接的U3-nRNA和其它5个蛋白

功能： 分离pre-rRNA

相关性： 皮肌炎： 5% - 10%

HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：抗NOR

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HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：抗Ku

多肌炎和皮肌炎的抗体谱

靶抗原 阳性率 （%）

ssDNA 40-50

Jo-1 25-35

PM-Scl （重叠综合征） 8

Mi-2 5

Ku （带硬皮病的重叠综合征） 1-7

PL-7、PL-12、OJ、EJ、KJ 2-3

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HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏:抗Jo-1

Jo-1

靶抗原： 组氨酰tRNA合成酶（50 kDa）

细胞浆磷脂蛋白

功能：将氨基酸与相应的tRNA连接

相关性： 多肌炎、皮肌炎 25% - 35%

伴有肺间质纤维化的多肌炎 70%

原发性胆汁性肝硬化的自身抗体谱

靶抗原 阳性率 （%）

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AMA M2 85-95

AMA M4 40-60

AMA M9 35

Sp-100 （nuclear dots） 30

Actin 10-20

HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：抗线粒体

抗AMA M2 抗体

靶抗原：含3个不同的酰基转移酶的多酶复合物:

- 丙酮酸脱氢酶 （74 kDa）

- 2-酮酸脱氢酶 （50 kDa）

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- 2-酮戊酸脱氢酶 （50 kDa）

蛋白X (52 kDa), 与丙酮酸脱氢酶复合物相关

相关性： PBC: 85% - 95%

HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏:核点型

HEp-2 细胞 / 大鼠肾:核点型 / AMA

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HEp-2 细胞 / 灵长类肝脏：着丝点 + 核点型

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗肌动蛋白

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗核膜型

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联合a生物薄片（HEp-2/猴肝冰冻组织切片）检测到的一些少见的特殊的荧光模型

与细胞周期相关的荧光模型

HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗周期蛋白I

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗周期蛋白II

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HEp-2细胞/灵长类肝脏：中心粒

HEp-2细胞/灵长类肝脏：纺锤体纤维

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HEp-2细胞/灵长类肝脏：中间体

细胞浆中的抗体

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗溶酶体抗体

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HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗高尔基体

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗波形蛋白

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HEp-2 细胞/灵长类肝脏：抗原肌球蛋白

灵长类肝脏：抗肌内膜抗体

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灵长类肝脏： 抗胆管抗体

灵长类肝脏： ANCA

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c-ANCA阳性 p-ANCA阳性

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