一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法[发明专利]

*CN1031027A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 1031027 A(43)申请公布日 2013.05.15

(12)发明专利申请

(21)申请号 201310018497.5(22)申请日 2013.01.18

(71)申请人中南大学

地址410083 湖南沙市岳麓区麓山南路

932号(72)发明人何海伦 陈淑华 刘丹 杨兴昊

黄嘉丰(74)专利代理机构长沙市融智专利事务所

43114

代理人袁靖(51)Int.Cl.

G01N 27/447(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图1页权利要求书1页 说明书5页 附图1页

()发明名称

一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法(57)摘要

本发明提供了一种蛋白酶谱电泳检测方法，属于生物技术技术领域。该方法包括制胶、加样、电泳、洗胶、反应显色步骤，其中制胶时没有向凝胶里加入蛋白酶底物，而在显色之前将胶在1%的底物溶液中浸泡。避免了底物在胶中对蛋白迁移率的影响,不需要价格昂贵的电转设备,可以用于各种蛋白酶谱的检测，应用广泛。

CN 1031027 ACN 1031027 A

权 利 要 求 书

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1.一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法，其特征在于，包括以下步骤： a．制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶；

b．样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；

c．电泳； d．洗胶；

e．将胶在底物溶液中浸泡； f．反应显色。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚兰0.1%、甘油25%组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4：1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为0.25-2%底物的溶液中，30-40°C温浴1-3h。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 1）．配制质量浓度为12.5%的分离胶：30%凝胶贮备液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸馏水1.4ml，10%过硫酸胺25μl，TEMED 2.5μl；混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5%的上层浓缩胶：30%凝胶贮备液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸馏水0.5ml，10%过硫酸胺20μl，TEMED 2.0μl；插入梳子，避免混入气泡，放置室温下；

2）．将样品与加样缓冲液混匀后加样； 3）．电泳缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚兰指示剂到达胶的最前沿；

4）．电泳结束后，用预冷的2.5%Triton X-100将胶洗三次，每次15min；然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100；

5）．将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为1%底物的溶液中，37°C温浴2h后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净，用0.1%（w/v）的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为：1g考马斯亮蓝R-250，350ml乙 醇，100ml乙酸，加水至1000ml；脱色液配方为：250ml乙醇,100ml乙酸,加水至1000ml。

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说 明 书

一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及一种新型蛋白酶谱的电泳检测方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

蛋白酶（proteases,proteinases）也称为肽酶（peptidases），是一类能水解蛋白

质和多肽水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，执行许多不同的生理功能。根据不同的标准可以将蛋白酶分成很多种。根据水解肽键的方式，可细分为内肽酶、外肽酶、转肽酶等。根据最适pH，可以将蛋白酶分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。MEROPS数据库记录了蛋白酶及蛋白酶的肽类抑制剂的相关信息，根据催化中心参与催化的氨基酸的不同，在该数据库中蛋白酶可分成6大类：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和未知催化类型的蛋白酶。蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，占了世界酶类销售总额的60%，在食品、医药、纺织、制革、洗涤剂、化妆品、动植物蛋白以及废物处理等行业都有着很好的应用前景。[0003] 酶谱分析是一种电泳技术，是在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的基础上发展而来的，它在聚丙烯酰胺凝胶中添加了底物分子，从而可以检测酶活性。虽然存在许多不同类型的酶谱分析（根据酶的类型），其中使用最频繁的检测蛋白酶活性的是明胶酶谱分析。上样缓冲液配方与标准的SDS-PAGE上样缓冲液基本相同，但是不含还原剂[2-mercaptoetanol，二硫苏糖醇（DTT）]，也不加热。电泳结束后，将SDS凝胶在Triton X-100中洗3次，然后将其孵育于一个适当的反应缓冲液中，使酶和底物发生反应，随后SDS凝胶进行考马斯亮蓝染色，被酶降解的区域会有明显的条带显示。经过五十多年的发展，酶谱法也衍生出很多新的技术，具体有：（1）常规方法，一维酶谱电泳胶中添加蛋白酶底物与胶共聚合。电泳结束后，酶进行胶内复性，降解胶中的底物，此时在胶的蓝色背景下会出现白色透明水解条带。（2）二维酶谱电泳的原理同一维酶谱电泳，但样品事先要经过等电聚焦（IEF）初步分离，酶降解底物后胶上会有白色水解圈。（3）二维电泳结束后得到的水解圈，可通过MALDI-TOF/MS鉴定蛋白酶。（4）组织样品可直接进行胶内酶解（In-situ zymography，ISZ)，这样就可根据酶活对细胞定位。（5）实时定量酶谱法（Real-time zymography，RTZ)可对酶活的变化定时监测。（6）多层次底物酶谱法（Multiple layer substrate zymography，MLSZ)可以利用一块胶来检测不同的酶。具体方法是样品经电泳分离后再用电转的方法将胶里的蛋白转移到含不同底物的胶上。这就实现了一次电泳，多次检测的效果。（7）反向酶谱法（Reverse zymography），与其他酶谱法的胶内添加底物不同，这种方法是将酶加入胶中，然后检测酶的抑制剂。有抑制作用的会在亮的背景里出现黑色条带。

[0004] 其中底物胶方法虽然常被用来检测蛋白水解酶类的活性酶谱，但有些蛋白酶在含有底物的胶中的迁移率会受到严重影响，所以导致蛋白酶条带很难分开或是难以确定其分子量。为了解决这一问题，有些研究者就将此方法进行了改良，首先将蛋白酶样品首先进行不含底物的非变性的SDS-PAGE电泳，在通过电转将跑好的条带转移到事先准备好的含有

[0002]

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说 明 书

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底物蛋白的另一张凝胶上，反应一段时间后，第二张含有底物的授予胶去染色，脱色，会在相应的位置产生透明的条带。虽然该方法在一定程度上解决了底物对蛋白酶迁移率受到阻碍的问题，但是要求必须有电转装置，而且增加了操作步骤，在电转过程中还可能造成蛋白酶的失活。本发明针对上述问题进行了改良，通过底物浸泡方法解决了上述传统方法可能的造成的误差，可有效应用于蛋白酶谱分析。发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种更为快速准确地检测蛋白酶谱的新方法，应用该方法，可以减少传统底物胶方法蛋白条带堆积，分子量偏差，以及使用昂贵仪器的缺点，实现对多种蛋白酶谱进行高通量快速检测。[0006] 一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法，包括以下步骤：[0007] a．制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶；

[0008] b．样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；

[0009] c．电泳；[0010] d．洗胶；

[0011] e．将胶在底物溶液中浸泡；[0012] f．反应显色；

[0013] 步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚兰0.1%、甘油25%组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4：1。

[0014] 步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为1%底物的溶液中，37°C温浴2h。

[0015] 上述方法具体包括以下步骤：[0016] 1）．配制质量浓度为12.5%的分离胶：30%凝胶贮备液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸馏水1.4ml，10%过硫酸胺25μl，TEMED2.5μl；混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5%的上层浓缩胶：30%凝胶贮备液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl0.35ml，蒸馏水0.5ml，10%过硫酸胺20μl，TEMED2.0μl；插入梳子，避免混入气泡，放置室温下；[0017] 2）．将样品与加样缓冲液混匀后加样；[0018] 3）．电泳缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚兰指示剂到达胶的最前沿；[0019] 4）．电泳结束后，用预冷的2.5%Triton X-100将胶洗三次，每次15min；然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100；[0020] 5）．将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为1%底物的溶液中，37°C温浴2h后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净，用0.1%（w/v）的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为：1g考马斯亮蓝R-250，350ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml；脱色液配方为：250ml乙醇,100ml乙酸,加

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说 明 书

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水至1000ml。本发明优点和有益效果：[0021] 1、运用底物浸泡方法测定蛋白酶谱，避免了底物在胶中对蛋白迁移率的影响，本发明所用的蛋白底物反浸的方法同底物胶的方法在耗时上基本相同，但是在活性条带的分子量的确定上却有着明显的优势，且活性条带更加清晰，如图2所示，非常有利于后续的蛋白酶鉴定工作；[0022] 2、重复性好，灵敏度高，活性条带测定准确，如图3所示；[0023] 3、本发明所用的蛋白底物反浸的方法同电转方法相比在耗时上明显缩短，省去了电转步骤，而且不需要电转装置，且在条带清晰度及分子量准确度上基本相同；[0024] 4、底物浸泡蛋白酶谱法可以用于各种蛋白酶谱的检测，有广阔的应用空间。附图说明

图1、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶谱检测；[0026] 图2、海洋弧菌（Vibrio sp.CSH1301）胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶谱检测；[0027] 1.为本发明的酪蛋白底物浸泡方法;2为酪蛋白底物胶方法；当SDS-PAGE胶中加入酪蛋白底物时，严重阻碍了胰蛋白酶的迁移率，酶解条带弥散，而本发明是将酪蛋白底物反浸入凝胶，所以不会对蛋白迁移率有任何影响，活性条带清晰；[0028] 图3、胰蛋白酶活性电泳；

[0029] 1.为本发明的酪蛋白底物浸泡方法;2为酪蛋白底物胶方法；胰蛋白酶分子量约为23.3kDa，当SDS-PAGE胶中加入酪蛋白底物时，严重阻碍了胰蛋白酶的迁移率，造成了胰蛋白酶分子量的偏差，而本发明由于是将底物反浸入凝胶，所以不会对蛋白迁移率有任何影响，而且活性条带清晰。

[0025]

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

[0031] 本发明使用的试剂：丙稀酰胺、N,N’-甲叉双丙稀酰胺、SDS、过硫酸氨(Sigma)，Tris(Sigma进口分装)，甘氨酸(国产)，酪蛋白(Sigma进口分装)，其他试剂均为普通市售产品。

[0032] 实施例1：短小芽孢杆菌蛋白酶底物浸泡法活性酶谱检测[0033] 所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：中国科学院微生物研究所，菌种编号CGMCC NO:1.1625。[0034] 步骤如下：[0035] （1）将购买的短小芽孢杆菌划线接种于固体培养基，在28℃条件下活化培养3天，然后接种于5ml液体LB培养基中，在28℃、200rpm的条件下震荡培养1天，然后按5%（v/v）的接种量接种于100ml的发酵培养基中，在28℃、200rpm的条件下震荡培养36h，10000rpm离心，制得发酵液；

[0036] 上述固体培养基组分如下，均为重量份：[0037] 蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，蒸馏水100份，pH为7.5～8.0；[0038] LB培养基组分如下，均为重量份：

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说 明 书

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蛋白胨1份，酵母粉0.5份，蒸馏水100份，pH为7.5～8.0；

[0040] 发酵培养基组分如下，均为重量份：[0041] 玉米粉1分，麸皮0.5份，豆粕1份，Na2HPO40.4份，KH2PO40.03份，CaCl20.1份，蒸馏水100份，pH7.5。[0042] （2）将步骤（1）制得发酵液在4℃条件下，10000rpm离心10min，取上清，制得胞外酶液；4℃冰箱保存待用。[0043] （3）配制12.5%分离胶：30%凝胶贮备液1.6ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)1.0ml，蒸馏水1.4ml，10%过硫酸胺25μl，TEMED2.5μl。混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。聚合完成之后，倒掉覆盖液体。配制5%上层浓缩胶：30%凝胶贮备液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸馏水0.5ml，10%过硫酸胺20μl，TEMED 2.0μl；插入梳子，小心避免混入气泡，放置室温下。[0044] （4）将步骤（2）制得的胞外酶液20μl与5μl加样缓冲液（使用的加样缓冲液配方为：60mMTris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚兰0.1%、甘油25%组成）混匀，样品不在沸水浴中加热。电泳采用垂直板式不连续系统电泳方法，在Mini PROTAIN3小型垂直电泳槽和蛋白质电泳仪电泳仪上进行。在冰浴中稳压120V电泳，分离样品直至溴酚兰指示剂到达胶的最前沿。

[0045] （5）电泳结束后，将步骤（4）得到的电泳凝胶用预冷的Triton X-100（2.5%）洗三次，每次15min。然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100。[0046] （6）将步骤（5）清洗好的胶浸泡在用pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制的含有1%酪蛋白溶液中，37°C温浴2h，然后用蒸馏水将胶上残留的酪蛋白冲洗干净，用0.1%（w/v）的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液脱色直至透明条带清晰。其中染色液配方为：1g考马斯亮蓝R-250，350ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml；脱色液配方为：250ml乙醇,100ml乙酸,加水至1000ml。酶谱条带如图1所示。[0047] 实施例2：海洋弧菌（Vibrio sp.CSH1301）胞外蛋白酶谱的测定及同底物胶方法比较

[0048] 各操作步骤同实施例1，所不同的是培养基中的蒸馏水换做海水，发酵培养时间为72小时。海洋弧菌（Vibrio sp.CSH1301）为本实验室分离自海口红树林海水的菌株。对照试验配制12.5%分离胶：30%凝胶贮备液1.6ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)1.0ml，蒸馏水1.0ml，1%的酪蛋白0.4ml，10%过硫酸胺25μl，TEMED 2.5μl。混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用，聚合完成之后，倒掉覆盖液体。配制5%上层浓缩胶，插入梳子，小心避免混入气泡，放置室温下。对照试验与本发明的不同在于配胶时加入终浓度0.1%的酪蛋白，其它的试验步骤及电泳仪器均相同。凝胶经漂洗后，底物胶浸泡在Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中37°C温浴2h，而非底物胶浸泡在Tris-HCl（pH8.0）缓冲液配制的含有1%酪蛋白的溶液中，37°C温浴2h，然后用考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，最后用脱色液脱色直至透明条带清晰。蛋白酶谱条带如图2所示。[0049] 实施例3：胰蛋白酶Trypsin蛋白酶谱的测定及同底物胶方法比较[0050] 各操作步骤同实施例，所不同的是采用购买的上海生工的商品酶制剂，胰蛋白酶

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说 明 书

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Trypsin，本发明的底物浸泡方法同底物胶方法进行对比。对照试验电泳胶配制同实施例2，37°C温浴2h，然后用考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，最后用脱色液脱色直至透明条带清晰。胰蛋白酶谱条带如图3所示。

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说 明 书 附 图

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图3