第29卷 第4期 2015_侄 齐鲁工业大学学报 V0l_29 No.4 Dec. 2015 12月 JOURNAL OF QILU UNIVERSITY 0F TECHNOLOGY 文章编号:1004—4280(2015)04—0001—05 DOI:10.16442/j.cnki.qlyd ̄b.g2015.4.0001 盂令超 ,孙清。,陈慧甜 ,刘长鑫 ,时国庆 , ,刘杰民 (1.北京科技大学化学与生物工程学院,北京100083; 2.北京农学院农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京102206) 摘 要:以双酚酸为起始原料,通过3碳间隔臂联接牛血清白蛋白(BSA),制备了双酚A(BPA)人工抗原1: BPA-C3-BSA。以双酚A为起始原料,在其中一个酚羟基位置通过4碳间隔臂联接BSA,制备了BPA人工抗原2: BPA-CA-BSA。分别将这两种抗原免疫Balb/C小鼠,经克隆、亚克隆后获得稳定分泌细胞株BPA1—6E3和BPA2—4C7。 步鉴定4C7的IgG亚型为IgG1,轻链亚型为K,抗体亲和常数为6.2x10 。抗体与双酚酸的交叉反应率为4.9%, 对细胞上清液中的抗体进行鉴定,两株细胞所分泌抗体对BPA的IC50值分别为43.76 ng/mL和3.56 ng/mL。进 一与双酚B的交叉反应率小于0.36%。初步实验表明,该抗体与BPA人工抗原2配对,可用于开发BPA酶联免疫试 关键词:双酚A;单克隆抗体;人工抗原 中图分类号:Q511 The Preparation of Bisphenol A Monoclonal Antibody MENG Ling-ehao’’ SUN Qing ,CHEN Hui-tian ,LIU Chang.xin ,SIll Guo—qing ’ ,LIU Jie.rain。 ,(1.School of Chemistry and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China; 2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and zzzPsg.Pesticides—Beijing University of A culture,Beijing 102206,China) Abstract:With diphenolicacid as a starting material,the BPA artiifcial antigen 1:BPA—C3一BSA was synthesized by coupling BSA to the methylene of BPA via a three—carbon spacer arm.Furthermore,BPA artificial antigen 2:BPA-C4-BSA was synthesized with BPA as a starting material by coupling BSA to one of the phenolic hydroxyl of BPAvia a four—carbon spacer arm.After immuning Balb/Cmice with these two antigens separately,BPA1-6E3 and BPA2-4C7 cell lines that stably secreting BPA antibodies were obtained after clone and subclone.The IC50 of the cell supematant from two cell lines to BPA were 43.76 irg/mL and 3.56 ng/mL respectively.The IgG subtypes of 4C7 is IgG1,light chain subtype is K.The afinitfy constant of 4C7 to BPA is 6.2xlO’The cross reactivity with diphenolicacid was 4.9% and with bisphenol B was less than 0.36%.Preliminary experiments show that antibody 4C7 can react with BPA— C4-BSA,which can be used to develop enzyme—linked immunoassay kit for BPA. Key words:bisphenol A;monoclonal antibody;artiicial antfigen 双酚A是世界范围内产量最大的化合物之一, 被大量用于制造环氧树脂和聚碳酸酯塑料。环氧树 脂通常用作食品罐头、金属瓶盖及输水管道中的防 收稿日期:2015—09一叭 网络出版时间:2015—12—30 基金项目:国家自然科学基金项目(21576023);国家高技术研究发展计划(2012AA101609—5) 作者简介:盂令超(199O一),男,山西朔州人,硕士生,研究方向:生化与分析化学. 通讯作者:时国庆(1972一),男,山东济南人,副教授,博士,硕士生导师,shiguoqing@ustb.edu.cn 刘杰民(1970一),男,内蒙古赤峰人,教授,博士,博士生导师,liujm@ustb.edu.cn. iole文献标识码:A 剂盒。 锈或防腐蚀油漆,聚碳酸酯塑料常被用于制造食品 和饮料中的包装盒或容器 卜 。另外,聚氯乙烯塑 料、某些阻燃剂、一些制作假牙或补牙的聚合物材料 Pfrp双酚A单克隆抗体的制备 2 齐鲁工业大学学报 第29卷 中也含有双酚A。通过各种途径的释放,双酚A已 BALB/C小鼠及SP2/O细胞,购自中国人民解 成为环境中分布最为广泛的污染物之一_3 J。近年 来的大量研究表明,双酚A具有雌激素活性,会导 致生殖和发育毒性;并且会影响实验动物的行为和 智力发育,影响免疫系统的正常功能 ;双酚A长 期暴露会造成实验动物糖尿病和肥胖的发展-o 。 基于对双酚A毒性的认识,目前很多国家已经禁止 放军军事医学科学院。 在婴幼儿奶瓶及其它食品包装材料中使用双酚 A E 一 。 目前,国内外关于双酚A的检测,主要采用高 效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、气一质联用法 (GC—MS)、液一质联用法(LC—MS)等 ,这些方法 虽然灵敏度高,但需要昂贵的仪器和专业的操作人 员以及较长的分析周期,对检验样品要求也比较高, 还需要对样品进一步的处理才能进行,已经不能满 足目前高效、准确、灵敏、快速的检测要求。国内外 对于双酚A酶联免疫检测技术的研究尚不多见,其 原因就在于缺少双酚A的特异性单克隆抗体。 由于双酚A是小分子,本身具有反应特异性, 但不具有免疫原性 。要制备相应的抗体,需要先 制备保留抗原决定簇的完全抗原。通过在双酚A 不同位置连接间隔臂,设计了两种不同的双酚A人 zzzPsg一工抗原,制备了单克隆抗体,并对抗体的免疫检测活 性进行了初步探究。 1材料与方法 1.1 实验动物 H0 iole13本)。 EDC。NHS BAS OH H H H K2CO3/Acetone 85*C/12 hH H 图1 BPA人工抗原的合成路线 1.4.2人工抗原Ⅱ的合成 将4.溴丁酸乙酯溶液滴加到BPA溶液中,将反 Pfrp板(Nunc,丹麦)。 1.3 仪器 1.2主要试剂及材料 双酚A(百灵威公司,中国);双酚酸(百灵威公 司,中国);4.溴丁酸乙酯(百灵威公司,中国);牛血 清白蛋白(sigma,美国);弗氏完全佐剂(sigma,美 国);弗氏不完全佐剂(sigma,美国);HAT(Gibco,美 国);HT(Gibco,美国);DMEM培养基(Gibco,美 国);50%PEG4000(SERVA,美国);胎牛血清(新西 兰);HRP标记羊抗鼠IgG(southerbiotech,美国);聚 苯乙烯酶标板(Nunc,丹麦),96孔及24孔细胞培养 MK3型酶联免疫检测仪(Thermo,美国);紫外一 可见分光光度计(尤尼柯上海);CO 培养箱(三洋, 1.4实验方法 1.4.1人工抗原I的合成 人工抗原I的合成路线如图1所示。首先将一 定量的双酚酸溶于一定体积的DMF中,配置特定浓 度的双酚酸溶液。在2 mL棕色瓶中加入一定量的 EDC溶液、一定量的NHS溶液,再向瓶中缓慢滴加 定量的双酚酸溶液,室温振荡过夜。将活化好的 双酚酸缓慢加入到BSA溶液中,室温振荡2 h后,在 PBS透析液中透析3 d后即得人工抗原I,4℃保 存。 H 人工抗原I NaOH/85℃ e thanol/H20 O H S 人工抗原Ⅱ 应溶液置于油浴中加热回流12 h。将反应混合物过 滤,滤液吹干得到产物粗品。将之溶于乙酸乙酯,然 第4期 孟令超,等:双酚A单克隆抗体的制备 3 后依次用1 M盐酸、1 M碳酸氢钠和4 M氯化钠溶 液洗涤,乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥,蒸干后用硅 胶柱分离纯化得到BPA的乙酸酯。将BPA的乙酸 酯溶于乙醇,然后将4 M氢氧化钠溶液加入其中。 反应液在油浴中加热回流1 h,吹干得到产物粗品。 用水将粗品溶解,用1 M盐酸调制pH=4,然后用乙 酸乙酯萃取(2 mLx3),乙酸乙酯相用无水硫酸钠干 燥,吹干得到BPA的羧酸(BPAB)。称重BPAB,将 之配制成10 mg/mL的DMF溶液。向BPAB溶液中 依次加入EDC、NHS,室温振荡过夜。然后将活化好 的BPAB缓慢加入到BSA溶液中,继续室温振荡 2 h,反应产物以3 000 r/min的速度离心30 min,在 PBS透析液中透析3 d,即得人工抗原Ⅱ,4℃保存, 合成路线见图1。 分别利用SDS—PAGE和紫外吸收光谱对人工 抗原I和人工抗原Ⅱ进行鉴定。并按照公式(1)计 算BPA在BSA上的偶联率: 偶联率:(£BPA_BsA一8BsA)/£BPA。 (1)e1.4.3小鼠免疫及单克隆抗备 l 用BPA—BSA人工抗原皮下注射6—8周的 BALB/c小鼠,每次免疫量100 g/只,第一次免疫 o时将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后注射小 鼠,第2次和第3次免疫时将抗原与等量的弗氏不 i完全佐剂充分乳化后注射,免疫间隔时间为21融合前取血清测抗体 g d。 细胞融合前3 d采取腹腔直接注射法进行加强免 疫,免疫抗原量为100 g效价。取免疫BALB/c小鼠的脾细胞与Sp2/0细胞 在PEG(MW=4 000)介导下进行融合.常规培养。s/只, 5 d后,对有克隆生长孔的上清用间接ELIPSA法检测 抗体产生情况。以连续3次检测OD值大于阴性对 照2倍以上者为阳性克隆,采用有限稀释法对其进 行克隆化。z 采用动物体内诱生产腹水法制备单克隆抗体。 于BALB/c小鼠腹腔注射降植烷0.2 mL/只。24 h 后注射0.5 mL杂交瘤细胞的不完全培养液。6—9 d 后抽取腹水,采用Protein A亲和柱对腹水进行抗体 纯化,用紫外分光光度计测抗体含量。 1.4.4间接EuSA方法 1)用碳酸盐缓冲液(pH=9.6)将BPA—BSA稀 释至适当浓瘦,每孔100 L包被酶标板,4℃过夜。 用PBST溶液(pH=7.4)洗三次,每次3 min。 2)每孑L加封闭液150 p,L,37 oC孵育1 h,洗涤同 上。 3)用PBST将待测抗体稀释成不同浓度顺序加 入,每孔100 p.L,每次测定设空白对照、阴性对照和 阳性对照各2孔,37℃孵育1 h,洗涤同上。 4)用PBST将酶标二抗稀释成一定浓度,每孔 100 ,37 oC孵育l育15 rain。 板,使用酶标仪于450 lp h,洗涤同上。 5)每孔加新鲜配置的底物溶液100 p.L,37 oC孵 6)每孔加终止液(2 M H:SO )50 L,振荡酶标 lnl波长处进行OD值检测 (以630 nm波长为参比波长),保存并处理数据。r 1.4.5单克隆抗体的鉴定 利用免疫球蛋白亚型试剂盒对其进行亚型分 析。采用ELIfSA方法测定该抗体的亲和常数:取3 种倍比稀释度的BPA—BSA包被酶标板,以单克隆 抗体浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制三条测试 曲线。每条曲线50%OD值对应的抗体浓度分别 记为[Ab ]、[Ab ]、[Ab,],P对应K值分别为: K =1/2{2[Ab,]-[Ab ]} K2=1/2{2[Ab3].[Ab ]} K3=3/2{2[Ab 卜[Ab。]}, 抗体的亲和常数: K=1/3(K1+K2+K3)。 采用竞争ELISA方法测定单克隆抗体与BPA 结构类似物双酚酸和双酚B的交叉反应性。ELISA 步骤与1.4.4相似,仅将步骤3变为工作浓度的抗 体50 L加不同浓度DBP或其结构类似物溶液 50 ,其它步骤不变。以BPA或其结构类似物浓 度为横坐标,以B/B0值为纵坐标(B为样品孔对应 的吸光度值,B0为标准品浓度为零时空白溶液孔对 应的吸光度值),绘制测试曲线。根据测试曲线,计 算B/B0值为0.5时所对应的BPA或其结构类似物 浓度,记为IC50值。按照公式(2)计算交叉反应 率㈨: 交叉反应率=IC 。(BPA)/IC 。(结构类似物)x 100% (2) 2结果与讨论 2.1 BPA人工抗原的制备 BPA人工抗原I是通过将双酚酸的羧基与 BSA蛋白表面的氨基形成酰胺键,从而相当于在双 酚A分子中间的亚甲基位置通过一个三碳间隔臂 将双酚A的特征基团展示在BSA蛋白表面;而BPA 人工抗原Ⅱ则是通过在BPA一端的酚羟基上连接 四碳间隔臂,将BPA与BSA偶联。图2表明,两种 人工抗原的分子量都大于BSA,说明BPA偶联到了 BSA上。根据其在276 nm处的紫外吸收,计算得到 zzzzzPsgiolePfrp第4期 孟令超,等:双酚A单克隆抗体的制备 5 法定单位和词头的使用规则 1.单位与词头的名称,一般只宜在叙述性文字中使用。单位和词头的符号,在公式、数据表、曲线图、刻 度盘和产品铭牌等需要简单明了表示的地方使用,也可用于叙述性文字中。 2.单位的名称或符号必须作为一个整体使用,不得拆开。 3.选用SI单位的倍数单位或分数单位,一般应使量的数值处于0.1—1000范围内。某些场合习惯使用 的单位可以不受上述。例如:大部分机械制图使用的长度单位可以用“mm(毫米)”;导线截面积使用的 面积单位可以用“mm (平方毫米)”。在同一个量的数值表中或叙述同一个量的文章中,为对照方便而使用 相同的单位时,数值不受。词头h、da、d、C(百、十、分、厘),一般用于某些长度、面积和体积的单位中,但 根据习惯和方便也可用于其他场合。 zzzPsg一4.有些非法定单位,可以按习惯用SI词头构成倍数单位或分数单位。法定单位中的摄氏度以及非十进 制的单位,如平面角单位“度”、“[角]分”、“[角]秒”与时间单位“分”、“时”、“日”等,不得用sI词头构成倍 数单位或分数单位。 5.不得使用重叠的词头。亿(10 )、万(10 )等是我国习惯用的数词,仍可使用,但不是词头。习惯使用 的统计单位,如万公里可记为“万km”或“10 km”;万吨公里可记为“万t・km”或“10 t・km”。 6.只走通过相乘构成的组合单位在加词头时,词头通常加在组合单位中的第一个单位之前。 7.只通过相除构成的组合单位或通过乘和除构成的组合单位在加词头时,词头一般应加在分子中的第 8.当组合单位分母是长度、面积和体积单位时,按习惯与方便,分母中可以选用词头构成倍数单位或分 个单位之前,分母中一般不用词头。但质量的SI单位kg,这里不作为有词头的单位对待。 数单位。 9.一般不在组合单位的分子分母中同时采用词头,但质量单位kg这里不作为有词头对待。倍数单位和 分数单位的指数,指包括词头在内的单位的幂。 10.在计算中,建议所有量值都采用sI单位表示,词头应以相应的l0的幂代替(kg本身是sI单位,故不 1l,将SI词头的部分中文名称置于单位名称的简称之前构成中文符号时,应注意避免与中文数词混淆, 应换成10 g)。 必要时应使用圆括号。 iolePfrp